PCR反应及PCR产物的鉴定、回收与载体连接.docx

分子生物学试验报告

试验名称：PCR反响及PCR产物的鉴定、回收与载体连接

班级：生工xx姓名：xxx学号：xxxx日期：xxx

引言

PCR反响及PCR产物的鉴定、回收与载体连接

聚合酶链式反响〔polymerasechainreaction,PCR〕是体外酶促合成特异DNA片断的一种技术。由于这种方法高效、敏感、特异性高[1]，因而在分子生物学、基因工程争论以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和争论中得到广泛应用。通过本次试验来学习PCR反响的根本原理与试验技术，了解引物设计的一般要求，同时学习PCR产物的回收及其与载体连接的原理和方法。

材料和方法

试验原理

PCR反响的根本原理

聚合酶链式反响〔PCR〕是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火〔复性〕及适温延长等几步反响组成一个周期，循环进展，使目的DNA得以快速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点[2]。PCR进展的根本条件是：以DNA为模板〔在RT-PCR中模板是RNA〕；以寡聚核苷酸为引物；需要4种dNTP作为底物；有耐高温的TaqDNA聚合酶。PCR每一个循环由三个步骤组成：①变性:加热模板DNA，使其解离成单链；②退火:降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA所需扩增序列结合；③延长:在适宜温度下，DNA聚合酶利用dNTP使引物3’端向前延长，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。

每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35-45个循环后，目标片段的扩增可达106-107倍。

由于DNA的琼脂糖凝胶电泳已于试验一具体阐述与试验，此次不再赘述。

PCR产物的回收与载体连接原理

DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中通上肯定电压进展电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分别开。切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。本试验承受胶回收法来回收PCR产物。

利用Taq酶能够在PCR产物的3”末端加上一个非模板依靠的A，而T载体是一种带有3”T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。

其中，pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体。这种载体是由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进展酶切反响后，再在两侧的3”端添加“T”而成。因大局部耐热性DNA聚合酶进展PCR反响时都有在PCR产物的3”末端添加一个“A”的特性，所以使用这两种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。该载体携带有抗氨苄青霉素基因，因而使承受了该质粒的受体菌具有

抗氨苄青霉素的特性，同时还能进展蓝白斑筛选[2。]图1为pMD18-TVector的克隆位点图。

试验材料

药品及试剂

所用药品及试剂有电泳液〔TAE缓冲液〕；模板；上下游引物；dNTP；buffer；

rTaq酶；0.9%琼脂糖；荧光染料；loadingbuffer；DNAMarker；酚氯仿异戊醇；

3mol/L的NaAc(PH5.2)；无水乙醇；70%乙醇；TE溶液；T载体；ddH2O；SolutionI。

图1

图1pMD18-TVector的克隆位点图

试验仪器用具

用到的仪器及用具有台式型离心机、旋涡混合器、移液枪、锥形瓶、微波炉、琼脂糖凝胶电泳仪、PCR扩增仪、紫外线透射仪等。

试验方法

PCR反响：在PCR管中用移液枪分别参加0.5ul模板、0.3ul上下游引物、2uldNTP、2ulbuffer、14.65ulddH20、0.25ulrTaq酶，混匀，共计20ul。在PCR扩增仪上设置扩增程序：预变性条件为94℃下加热3min，变性条件为94℃下加热30s，退火条件为60℃下加热30s，延长条件为72℃下加热45s〔设置30个循环〕，末端延长条件为72℃下加热10min，于4℃下可永久保存。

PCR产物凝胶电泳：用胶带将制胶板两头封严，然后配0.9%琼脂糖凝胶30ml：称取0.27g琼脂糖参加1×TAE缓冲液30ml，用微波炉溶胶。冷却至不烫手加荧光染料2ul混匀，倒胶，马上插上梳子，冷却20min，轻轻拔出梳子，马上将凝胶板放入电泳槽，倒入1×TAE电泳缓冲液，使电泳液完全没过胶。将5ulPCR产物与1ulloadingbuffer混匀点入点样孔，最终点5ulDNAMarker。连接电泳槽，留意正负极，DNA从负极向正极跑