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PCR过程问题全解

如何防止PCR形成引物二聚体？

在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，比照marker时都不简洁看出其大小，具体是什么缘由呢？PCR时模板DNA浓度一般是多少最适宜？

答：1这条亮带假设在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的缘由很多，如引物设计的不好，在两端简洁形成回文构造或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有到达最正确，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着转变一下循环数，或许会有帮助。

PCR模板大约在104-106个拷贝。

答2：我觉得是目的条带含量太多了，假设点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。可以试着削减模板量，稀释10倍或是削减循环数。

答3：1.从引物自身着手，重设计引物，这是最根本解决这一问题的方法；

可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致；

Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后快速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再参加反响体系当中，引物二聚体就会消逝的；

所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增加特异性；

PCR反响体系的配制在冰上进展，最终加TAq酶，PCR完毕后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。

增加循环数可以适当降低引物二聚体；

降低退火温度后有条带，则应渐渐提高温度，假设提高温度的同时产物量削减，则考虑增加镁离子浓度〔依据扩增片断长度而定，片

段长则相应镁离子浓度应当高一些〕；

假设降低退火温度，觉察还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区分，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。

以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，削减引物二聚体，假设两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，假设间隔较长可以稀释50－100倍。

PCR假阴性的缘由分析

PCR的假阳性问题是在PCR诞生之初就被深刻生疏到了，同时由于造成假阳性的因素相

对单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要缘由。假设一个工程只是阳性率高敏感性好的话，那么可以认为其阴性结果具备很高的可排解性，仍旧有相当的临床适用价值。但PCR的假阴性在检验工作中仍很严峻，并且用些因素常常被人无视，严峻的影响了PCR的使用。可以想象一种假阳性和假阴性都很高的工程，有什么样的诊断价值。造成PCR假阴性的缘由是简单的，也是多样的。主要有：

PCR仪本身的质量问题。PCR仪设计原理上的差异和常常消灭的质量问题〔如：温控不准等〕给临床带来了诸如非特异性扩增〔假阳性〕、扩增效率下降(假阴性〕等问题.

离心机问题。离心机的质量或使用不正确，造成离心标本模板没有分别出来造成假阴性，窃以为这是最易被无视的问题。其时离心机使用问题不仅在PCR，在整个检验工作中都是最易被无视的问题，只是由于在其他工作中不象PCR那样明显影响检测结果罢了。

离心机是常用的固液分别设备，其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分别出来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速，依据牛顿定律可知离心力加速度与转速和有效半径的有关的，因此对于不同有效半径的离心机一样的转速其离心加速度是不同的，转速的调整要因离心机而异，但很圆满，日常工作中无视了这个问题。有效半径短的离心加速度就小，同样的时间离心效果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生

大量的热，因此对于称能上几万转/分而没有抽真空的离心机实际转速本人持疑心态度。

试剂开壳剂和操作问题造成标本DNA没有暴露出来，致使扩增无法进展，这是造成假阴性的又一主要因素。

问题1：无扩增产物

现象：正比照有条带，而样品则无缘由:

1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不适宜

引物设计不当或者发生降解

反响条件：退火温度太高，延长时间太短对策:

1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度

重设计引物〔避开链间二聚体和链内二级构造〕或者换一管引物

降低退火温度、延长延长时间

问题2：非特异性扩增现象：条带与估量的大小不全都或者非特异性扩增带缘由：

引物特异性差

模板或引物浓度过高

酶量过多

Mg2+浓度偏高

退火温度偏低

循环次数过多对策：

重设计引物或者使用巢式PCR

适当降低模板或引物浓度

适当削减酶量

降低镁离子浓度

适当提高退火温度或使用二阶段温度法

削减循环次数