药物分析与检验：第八章 电泳法分析.ppt

（一）原理：等电聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH值梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH值位置上。（二）优点：分辨率高，等电聚焦区带窄，稳定，精确度高，浓度低样品液可分离，浓缩作用。

六、等电聚焦电泳法

第八章电泳法分析生命科学学院制药工程电泳技术原理1各种电泳技术2本章内容第八章电泳法分析第一节电泳技术原理一、电泳指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。当溶液pH大于蛋白质pI，蛋白质带负电，在电场中向正极移动。如果pH小于pI，带正电荷，向负极移动。蛋白质pH值在蛋白质等电点时，在电场中不向任何一极移动。二、电泳技术分类按支持介质不同分为纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳。按凝胶形状分为水平平板电泳，圆盘柱状电泳，垂直平板电泳。三、迁移率定义：指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。影响迁移率因素：电荷：迁移率与颗粒表面电荷成正比。颗粒大小和形状：迁移率与颗粒半径，介质黏度成反比。电场强度：指单位长度支持物体上的电位降。电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。常压电泳（100-500V）高压电泳（500-10000V）缓冲溶液pH值：决定颗粒带电情况溶液离子强度：离子强度越高，迁移率越小温度和黏度第二节各种电泳技术纸电泳法醋酸纤维素电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法高效毛细管电泳等电聚焦电泳（一）仪器装置（水平式电泳室）

一、纸电泳法

一、纸电泳法

（二）操作方法：1电泳缓冲液：枸橼酸盐缓冲液2滤纸：选择质地均匀，吸附力小的滤纸3点样湿法点样：将裁好的滤纸全部浸入电泳缓冲液湿润后取出，夹在干燥滤纸中吸干平放滤纸上，滤纸两端浸入缓冲液，微量注射器10微升点样。干法点样：将样品直接点在滤纸上吹干，点完规定量的样品溶液，喷雾器滤纸喷湿，适于低浓度样品溶液。4电泳样品点移6-8cm切断电源，一般电压梯度18-20V/cm，1-2小时，紫外光检视。5剪下样品供试液斑点和斑点位置面积接近的空白滤纸，剪成细条放于试管，加盐酸溶液过滤离心取上清液测吸光度值，计算含量。例：三磷酸腺苷二钠片的含量测定三磷酸腺苷二钠（ATP）在生产过程及贮存期间均易引入二磷酸腺苷（ADP）与单磷酸腺苷（AMP）等杂质。1缓冲液与滤纸制备枸橼酸盐缓冲液（pH3.0）滤纸甲酸溶液浸泡，水漂洗，烘箱烘干2供试品溶液的制备精密称取加水，振摇，取滤液3电泳距底部5cm划基线，干法点样，放置于电泳槽架，电泳1-1.5h，吹干，置紫外灯检视，铅笔划出紫色斑4含量测定剪下供试品斑点和与斑点位置面积接近的空白滤纸，剪成细条放于试管，加盐酸溶液过滤离心取上清液，257nm波长处测吸光度值，计算含量。

一、纸电泳法

1试剂：缓冲液配置：醋酸-锂盐缓冲液染色液：甲苯胺蓝溶液2操作：制胶：琼脂糖加水，加热后溶胀，加缓冲液，涂布玻璃板上点样与电泳：电泳槽加入缓冲液，凝胶板放置电泳槽架上染色：甲苯胺蓝，水洗多余染色液3优点：电泳速度快，分辨率高，透明而不吸收紫外线，区带易染色，样品易回收

二、琼脂糖凝胶电泳法

醋酸纤维薄膜由醋酸纤维素加工制成。1试剂配置：巴比妥缓冲液，氨基黑染色液，漂洗液透明液2操作：点样，电泳，染色，漂洗，透明，含量测定（洗脱法，扫描法）3优点：电泳区带清晰，电泳速度快，蛋白质，染料不吸附，无拖尾现象。

三、醋酸纤维素薄膜电泳法

（一）支持介质是聚丙烯酰胺凝胶，是常用的电泳方法。（二）制备原理聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺聚合而成。化学聚合（过硫酸铵）光聚合（核黄素）（三）优点：1电渗作用小2凝胶孔径可按需要控制大小3热稳定性好4化学纯度高，污染小。5280nm波长处无吸收，利于蛋白质检测。

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法

（四）电泳原理：1样品浓缩效应连续系统和不连续系统浓缩胶：样品浓缩在胶界积聚薄层分离胶：电泳2凝胶分子筛效应3电泳分离电荷效应

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法

（五）操作方法仪器装置：电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成试剂：三羟基甲基氨基甲烷，四甲基乙二胺