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GATK使用方法详解-plob最详尽说明书

1.对原始下机fastq文件进行过滤和比对（mapping）

对于Illumina下机数据推荐使用bwa进行mapping。

Bwa比对步骤大致如下：

（1）对参考基因组构建索引：

例子：bwaindex-abwtswhg19.fa。

构建索引时需要注意的问题：bwa构建索引有两种算法，两种算法都是基于BWT的，这两种算法通过参数-ais和-abwtsw进行选择。其中-abwtsw对于短的参考序列是不工作的，必须要大于等于10Mb；-ais是默认参数，这个参数不适用于大的参考序列，必须要小于等于2G。

（2）寻找输入reads文件的SA坐标。

对于pairend数据，每个reads文件单独做运算，singleend数据就不用说了，只有一个文件。

pairend：

bwaalnhg19.faread1.fq.gz-t4-Iread1.fq.gz.sai

bwaalnhg19.faread2.fq.gz-t4-Iread2.fq.gz.sai

singleend：

bwaalnhg19.faread.fq.gz-l30-k2-t4-Iread.fq.gz.sai

主要参数说明：

-oint：允许出现的最大gap数。

-eint：每个gap允许的最大长度。

-dint：不允许在3’端出现大于多少bp的deletion。

-iint：不允许在reads两端出现大于多少bp的indel。

-lint：Read前多少个碱基作为seed，如果设置的seed大于read长度，将无法继续，最好设置在25-35，与-k2配合使用。

-kint：在seed中的最大编辑距离，使用默认2，与-l配合使用。

-tint：要使用的线程数。

-Rint：此参数只应用于pairend中，当没有出现大于此值的最佳比对结果时，将会降低标准再次进行比对。增加这个值可以提高配对比对的准确率，但是同时会消耗更长的时间，默认是32。

-Iint：表示输入的文件格式为Illumina1.3+数据格式。

-Bint：设置标记序列。从5’端开始多少个碱基作为标记序列，当-B为正值时，在比对之前会将每个read的标记序列剪切，并将此标记序列表示在BCSAM标签里，对于pairend数据，两端的标记序列会被连接。

-b：指定输入格式为bam格式。这是一个很奇怪的功能，就是对其它软件的bam文件进行重新比对的意思

bwaalnhg19.faread.bamread.fq.gz.sai

（3）生成sam格式的比对文件。如果一条read比对到多个位置，会随机选择一种。

例子：singleend：

bwasamsehg19.faread.fq.gz.sairead.fq.gzread.fq.gz.sam

参数：

-nint：如果reads比对次数超过多少次，就不在XA标签显示。

-rstr：定义头文件。‘@RG\tID:foo\tSM:bar’，如果在此步骤不进行头文件定义，在后续\oViewallpostsinGATK\t/2014/04/14/_blankGATK分析中还是需要重新增加头文件。

pairend：

bwasampe-a500read1.fq.gz.sairead2.fq.gz.sairead1.fq.gzread2.fq.gzread.sam

参数：

-aint：最大插入片段大小。

-oint：pairend两reads中其中之一所允许配对的最大次数，超过该次数，将被视为

singleend。降低这个参数，可以加快运算速度，对于少于30bp的read，建议降低-o值。

-rstr：定义头文件。同singleend。

-nint：每对reads输出到结果中的最多比对数。

对于最后得到的sam文件，将比对上的结果提取出来（awk即可处理），即可直接用于\oViewallpostsinGATK\t/2014/04/14/_blankGATK的分析。

注意：由于\oViewallpostsinGATK\t/2014/04/14/_blankGATK在下游的snp-calling时，是按染色体进行call-snp的。因此，在准备原始sam文件时，可以先按染色体将文件分开，这样会提高运行速度。但是当数据量不足时，可能会影响后续的VQSR分析，这是需要注意的。

2.对sam文件进行进行重新排序（reorder）

由BWA生成的sam文件时按字典式排序法进行的排序（lexicographically）进