荧光定量PCR概述（基础篇 ）-江志辉.pptx

;1;;荧光定量PCR（FlurogenicQuantitativePolymeraseChainReaction，FQ-PCR、RT-QPCRorQPCR）是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，最后通过Ct值和标准曲线对未知目标进行定量分析的方法。

实验常用的化学荧光分类有SYBRGreen荧光染料法和TaqMan探针法。

;荧光染料也称为DNA结合染料，染料与DNA双链在激发光源的照射下发出荧光信号，其信号强度代表双链DNA分子的数量。随着PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大。不掺入DNA双链的染料不会被激发出任何荧光信号。目前主要使用的染料分子是SYBRGreenⅠ，但是染料没有引物特异性，能与任何双链DNA结合，所以它也能和非特异性的双链DNA（如引物二聚体）结合。

;荧光探针以TaqMan水解探针为代表，也称为外切酶核酸探针。其基本原理是利用Taq酶的5‘外切酶活性，依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5‘端标记报告基团（荧光基团），3’端标记淬灭基团。扩增时，引物与特异性探针同时结合到模板上，探针结合位置位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合位置时，Taq酶利用5‘→3’外切酶活性，将探针5‘端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两个荧光分子间的荧光共振能量转移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET），从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物数量成正比。因此，根据PCR反应体系中的荧光强度可以计算出初始DNA模板数量。;荧光定量PCR原理介绍;在实时荧光PCR中，模板定量有2种方法：绝对定量和相对定量。

绝对定量是用已知标曲来推算未知（目的）样本的拷贝数。

相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。（即某基因在经过某种处理后基因表达量增加或是减少，用相对定量）

在相对定量中，比较Ct法使用较为广泛。比较Ct法运用数学公式来计算相对量。用比较Ct相对定量法进行基因表达定量时，来自于同一样本的目的基因和内参基因都要进行实时荧光定量PCR反应，定量结果由目的基因与内参基因Ct之间的差值（△Ct）来反映。因此，与绝对定量相比，比较Ct法省去了构建标准曲线的麻烦。另外，因为使用了参照样品，比较Ct法的相对定量使机体的不同组织，以及不同实验处理组之间的基因表达的变化具有可比性。

;内参基因：也称为管家基因，其编码蛋白是维持细胞基本生命活动所必须的蛋白质。它的表达水平不受任何内源性与外源性因素的影响。管家基因高度保守且在大多数情况下持续表达，稳定表达于不同类型的细胞和组织中。

那内参基因与相对定量又有什么样的关系呢？我们通过以下实验案例一起了解一下。

;荧光定量PCR原理介绍;常见内参获取的途径有如下三个：

?途径一：通过查询相关文献，获取内参。

?途径二：选择常用的多个内参进行实验验证。较常见内参基因见右图表：

?途径三：通过查询ICG库，获取内参

网址：/index.php/Homo_sapiens

网站中搜集了文献报道的常见细胞/组织适用的内参。

;2-△△Ct法

（1）分别计算实验组和对照组的△Ct值

△Ct实验组=Ct目的-Ct内参△Ct对照组=Ct目的-Ct内参

注：实验时每组设置了4个复孔，下机统一剔除1个孔数据。所以每组都对应有3个Ct值，复孔间差值一般建议小于1。

（2）计算相对表达量

△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组→相对表达量=2-△△Ct

（3）统计学分析

由于每组设置了三个复孔，相对应的实验组和对照组分别计算得到三个相对表达量值（对照组的相对表达量为1），同一个组三个复孔的差值越小，相对表达量越接近，然后以各组的相对表达量数值用IBMSPSSStatistics19进行检验，从而评估目的基因在实验组和对照组中的相对表达差异。P＜0.05认为有统计学差异。

注：相对表达量是指目的基因在实验组中的表达相对于在对照组中表达的倍数。在P＜0.05的情况下，如果2-△△Ct小于1，说明目的基因表达下调；反之，则说明目的基因表达上调；P＞0.05时，认为组之间该目的基因表达量无差异性。;;荧光定量PCR实验流程;;（1）引物设计

实验室一般涉及到的RNA基因检测种类有：

1）mRNA（编码RNA）

2）miRNA（小分子RNA）

3）LncRNA（长链非编码RNA）

4）CircRNA（环状RNA）