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第四章目标基因获取;第一节基因组DNA片断化;因为带有粘性末端，产物能够直接与载体连接。;二、随机片断化;1）4bp内切酶;2.机械切割法;1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因构想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因论文。;①保护dNTP5’端P或3’端-OH;（2）合成过程;原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。;;固相磷酸三酯合成过程;化学合成DNA片断普通在200bp以内。;;2.互补延伸连接法;1.直接合成基因;DNA合成仪;将某种生物细胞整个基因组DNA切割成大小适当片断，并将全部这些片断都与适当载体连接，引入对应宿主细胞中保留和扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体全部基因，称为基因文库。;（2）当前惯用载体;断点完全随机，片断长度适当于载体连接。不能用普通限制性内切酶消化法。;（2）载体与基因组DNA大片段连接;各种酶接头能够向企业定做或购置。;;4.基因组文库大小;;1.cDNA;（1）不含内含子序列。
（2）能够在细菌中直接表示。
（3）包含了全部编码蛋白质基因。
（4）比DNA文库小多，轻易构建。;分离mRNA用商业化OligodT纤维柱。;;反转录酶;用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中mRNA。;;;;这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中mRNA，并将其降解成许多小片断。;;;在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。;;6.cDNA文库大小;三、文库查询（screening）;第四节目标基因分离和扩增;纤
维
柱;2.mRNA消解杂交;;A;3.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）;（2）12种锚定引物;（3）5’端随即引物;（4）随机引物与锚定引物成对扩增;（5）随机-锚定引物PCR产物电泳比较;二、PCR扩增取得目标基因;;（1）提取基因组totalRNA;;克隆外源基因
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