用于通过核酸聚合酶对衬底多核苷酸进行大小受控的同聚物加尾的方法和组合物的制作方法.pdf

用于通过核酸聚合酶对衬底多核苷酸进行大小受控的同聚

物加尾的方法和组合物的制作方法

用于通过核酸聚合酶对衬底多核苷酸进行大小受控的同聚

物加尾的方法和组合物的制作方法

本发明涉及用于将具有特定长度的尾部添加至衬底多核苷

酸的方法和组合物。本发明还涵盖用于将所加尾的衬底固定

至固体支持物的方法和组合物。本公开预期衰减子分子是与

添加至衬底多核苷酸的尾部序列缔合，并且控制尾部序列至

所述衬底多核苷酸的3末端的所述添加的任何生物分子。添

加至所述衬底多核苷酸的序列本文称为尾部序列，或简称尾

部，并且将核苷酸添加至衬底多核苷酸的过程本文称为加尾。

【专利说明】用于通过核酸聚合酶对衬底多核音酸进行大小

受控的同聚物加尾的方法和组合物

[0001]相关申请的交叉引用

[000引根据美国法典第35篇第119条（e)款，本申请要求

2012年3月13日提交的美国临时申请号61/610,296和

2012年3月21日提交的美国临时申请号61/613,784的优

先权权益，所述申请各自W引用的方式整体并入本文。发

明领域

[0003]本发明涉及用于将具有特定长度的尾部添加至衬底

多核巧酸的方法和组合物。本发明还涵盖用于将加尾衬底

固定至固体支持物的方法和组合物。

[0004]发明背景

[000引许多当前下一代测序（NG巧平台在测序之前都要求

特殊的DNA和RNA制备。最常用的制备涉及通过连接反应将

衔接子序列添加至双链DNA片段的末端。所述反应通常涉及

平末端DNA或在3末端处具有单个脱氧腺巧（dA)核巧酸的

DNAW及高浓度的DNA连接酶，并且所述反应导致形成大量

的嵌合模板。模板依赖性聚合酶如DNA特异性末端脱氧核

巧酸转移酶（TdT)W及RNA特异性聚（A)和聚扣）聚合酶可

能代表用于制备NGS分析所用的DNA和RNA的一种有吸引力

的替代方法，其中富有挑战性的问题是由该些酶产生的聚合

物尾部的长度在广泛范围（20个至500个核巧酸）内变化，

该取决于许多因素并且不易控巧||，因而降低了它们对NGS

的效用。

[000引发明概述

[0007]因此，本发明提供一种包含核酸聚合酶和衰减子分子

的组合物。本发明预期所述衰减子分子是与添加至衬底多

核巧酸的尾部序列缔合，并且控制尾部序列至所述衬底多核

巧酸的3末端的添加的任何生物分子。添加至所述衬底多核

巧酸的所述序列本文称为尾部序列，或简称尾部，并且将核

巧酸添加至衬底多核巧酸的过程本文称为加尾。如本文所

使用的衰减子分子是多核巧酸、多肤、多糖W及其组合。在

所述衰减子分子为多核巧酸的方面，进一步预期的是所述多

核巧酸为环状分子，或所述多核巧酸包含肤核酸、裂權多糖

(Schizophyllanpolysaccharide)、锁核酸W及其组合。

[0008]如上所述，所述衰减子分子与添加至所述衬底多核巧

酸的尾部序列缔合并且控核巧酸至所述衬底多核巧酸的

添加。在一些实施方案中，所述衰减子分子是与添加至衬底

多核巧酸的序列杂交的多核巧酸，其中添加至所述衬底多核

巧酸的核巧酸的数量基本上等于与所述尾部序列缔合的所

述衰减子分子的部分中的核巧酸的数量。在一些方面，添加

至所述衬底多核巧酸的核巧酸的数量基本上等于与所述尾

部序列缔合的所述衰减子分子中的核巧酸数量的倍数。如本

文所使用，术语基本上和基本上等于应理解成指的是近

似或近似相等。

[0009]在一些实施方案中，所述核酸聚合酶为模板依赖性聚

合酶。在一方面，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，并且在另

一方面，所述DNA聚合酶为末端脱氧核巧酸转移酶（TdT)。

在相关实施方案中，所述核酸聚合酶为RNA聚合酶，所述

RNA聚合酶在各个方面选自由聚（A)聚合酶、RNA特异性核

巧酸转移酶W及聚扣）聚合酶组成的组。

[0010]本发明预期的是，在一些实施方案中，所述衰减子分

子包含选自由W下组成的组的核巧酸；2-脱氧胸巧5-

一磯酸（dTMP)、2-脱氧鸟巧5-一磯酸（dGMP)、2-脱

氧腺巧5-一磯酸（dAMP)、2-脱氧胞巧5-一磯酸

（dCMP)、2-脱氧尿巧5--磯酸（加MP)、胸巧一磯酸

（TMP)、鸟巧一磯酸佑MP)、腺巧一磯酸（AMP)、胞巧一磯

酸（CMP)、尿巧一磯酸扣MP)