用基因变异的酵母YarrowiaLipolytica制造柠檬酸的生物技术方法.pdf

用基因变异的酵母YarrowiaLipolytica制造柠檬酸的生物

技术方法

专利名称：用基因变异的酵母YarrowiaLipolytica制造柠

檬酸的生物技术方法

技术领域：

本发明涉及用基因变异的酵母YarrowiaLipolytica(欧蓍

草脂解酶下称Y.Lipolytica)制造柠檬酸(CS)的生物技术

法。

目前，99％的柠檬酸是采用生物技术途径选择的子囊菌种墨

曲霉进行大规模工业生产的，特别是以糖蜜和其它含糖的农

业废料用作碳-源(c-源)，按这种方法也含生成大量液体和

固体的副产物。以结晶形态销售的柠檬酸广泛地用于各工业

部门，主要是在食品工业和医药工业中作为味觉载体、防腐

剂、酸味剂和抗氧剂使用(Roehretal.1996，citricacid，

Biotechnologyvol.6，RehmandReed，eds)。

有意义的是另一可选择的方法，它系用Y.Lipolytica酵母

生产柠檬酸，该方法基于此酵母的性能，能利用一系列疏水

性的作用物如植物性和动物性的油和油脂或正烷烃作为c-

源。从60年代中期以来已知Y.Lipolytica在特定条件下具

有分泌柠檬酸(cs)和异柠檬酸以及媒解代谢作用的其它代

谢产物，如丙酮酸酯和α-酮戊二酸酯的能力。自那时起广

泛地研究了相应的培养条件，对这类代谢物过量生产和析出

最重要的先决条件是同时存在可利用c-源的生产培养物的

生长限制(stottmeisteretal.1982，ZAllg

Mileroliol.22399-424)。此处培养物生长限制是通过限定

必要的营养培养基成分，例如矿物质、维生素和氨基酸来达

到的。所生产代谢产物的种类取决于起限制作用的营养物组

分和其它培养条件，如采用的c-源或生产培养基的pH-值。

氮-、磷-、硫-或镁-缺乏可导致柠檬酸和异柠檬酸的过量

生产[stottmeisteretal.1982，ZAllg.Mikrobiol

22399-424]。因而对营养缺陷型菌种通过氨基酸缺乏能诱发

cs/ics的生成(BarthimdKrebs1984，DD227448A1)；与此

相反，通过硫胺素缺乏的生长限制引起生成α-酮戊二酸和

丙酮酸酯，而硫胺素不只是由Y.Lipolytica本身生成的

(Weissbrodtetal.1988，DD267999A1，Chernyavskayaet

al.2000，ApplMicro-biolBiotechnol53152-158)。

在一柠檬酸生产的工业过程中，不希望同时产生10％以上的

异柠檬酸(以cs+1cs)总酸含量计，因为这会增加产品加工，

尤其是增加CS结晶的困难。

Cs/1cs产物的比例和产品收率对Y.Lipolytica的野生型菌

种与所用的c-源有关，对葡萄糖和甘油而言，Y.Lipolytica

生成约90％的CS和10％1CS(Tretonetal.1978，Appl

MicrobiolBiotechnol667-77)，在应用乙醇作为C-源时得

到相似的产物比例(Arzumanvvetal.2000，ApplMicrobiol

Biotechnol53525-529)。在用对工业应用有意义的疏水性作

用物，如植物油或n-烷烃时，产物比例移向1CS一部分从40

至50％。(概况一览参见Stotlmeisteretal.1982，zAllg

Mikrobiol22399-424，和Finogenova1991，inAlkane

metabolismandoversynlhesisofmetabolitesby

microorganismus，FinogenovaTVandsharyshevAA，

eds，CenterforBiologicalResearch，udssRAcademyof

Science，Pushchino，Russia，pp96-114)，降低这种高含

量的1CS-组分对用Y.Lipolytica进行工业规模生产柠檬酸

成为决定性的成本要素。

在此基础上对自发产生的或通达化学的或UV致突变制成的