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光谱分析技术 吉林大学生物基础实验教学中心 实验目的 学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理 了解仪器结构和分类 熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项 实验原理 构成物质的分子、原子或离子经辐射能照射后物质的总能量就会发生变化，在能量相互转化的过程中产生辐射信号或引起辐射信号变化。根据产生的辐射信号或引起信号变化，均可进行光谱分析。 1、光谱的分类 根据光的基本性质和它在传递能量过程所发生的变化和引起波长或传播方向的差异，可以将光谱分为3大类，即发射光谱、吸收光谱和散射光谱。 （1）发射光谱构成物质的分子、原子或离子，经辐射能照射吸收了能量，由基态能级转变成激发态能级后，处于激发态的物质内部能量比原来能量多，处于不稳定状态，需要把吸收多余的能量释放出去，再回到稳定的基态。因此，在该物质由激发态回到基态的过程中，系统内以光的形式释放多余的能量，并产生相对应波长的光谱，这种光谱称之为发射光谱 （2）吸收光谱构成物质的分子，原子或离子等在辐射能的照射下，在系统内吸收外界能量的过程中，所对应吸收的波长产生光谱，称之为吸收光谱。 （3）散射光谱构成物质的分子、原子或离子，经辐射能照射后，系统内散射出来的能量产生相对应波长的光谱，称之为散射光谱。散射光谱主要是以拉曼散射为基础形成的光谱，它主要分布在红外区，属于分子散射光谱 2、吸收光谱相关理论 (1) 光谱分析的常用术语 消光系数 是溶液对光吸收的比例常数，是指在一定的浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用K表示。K值取决于溶质性质、入射光波长和温度。 吸光度 又称光密度(OD)或吸光值(A)，表示溶液吸收光的强弱或吸收程度，也有用E表示。E值愈大，溶液对光吸收的程度愈大。 摩尔消光系数 溶液浓度为mol/L，光程厚度为lcm时的消光系数，其单位是L/(mol.cm)，用ε表示。ε值是物质的一个特征常数，由物质的性质与光的波长而定。同一物质在不同的波长所测得的ε值不同。一般采用ε值最大的波长进行比色测定。 （2）吸收光谱构成物质的分子，原子或离子等在辐射能的照射下，在系统内吸收外界能量的过程中，所对应吸收的波长产生光谱，称之为吸收光谱。 （3）散射光谱构成物质的分子、原子或离子，经辐射能照射后，系统内散射出来的能量产生相对应波长的光谱，称之为散射光谱。散射光谱主要是以拉曼散射为基础形成的光谱，它主要分布在红外区，属于分子散射光谱 2、吸收光谱相关理论 (1) 光谱分析的常用术语 消光系数 是溶液对光吸收的比例常数，是指在一定的浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用K表示。K值取决于溶质性质、入射光波长和温度。 吸光度 又称光密度(OD)或吸光值(A)，表示溶液吸收光的强弱或吸收程度，也有用E表示。E值愈大，溶液对光吸收的程度愈大。 摩尔消光系数 溶液浓度为mol/L，光程厚度为lcm时的消光系数，其单位是L/(mol.cm)，用ε表示。ε值是物质的一个特征常数，由物质的性质与光的波长而定。同一物质在不同的波长所测得的ε值不同。一般采用ε值最大的波长进行比色测定。 百分消光系数 是指被测物质的浓度以质量浓度表示时的消光系数。当溶液浓度为1g/100ml，光程为1cm时的消光系数，其单位是lOOmL/(g.cm)，用 表示。值是生物大分子常用的消光系数，由于生物大分子的分子量太大，一般不用摩尔浓度，而用百分浓度表示，所以测定时用表示，它是表示生物大分子的一个特征常数。光吸收 当一定波长的光通过某介质时，该介质有选择地吸收某一波长的光，使入射光的强度减弱，这种现象称为光吸收。一束连续光经棱镜色散后所得到的光谱中，就出现一处或几处暗的部分谱带，这种通过介质的光呈现出射光，透过介质产生的光谱就吸收光谱。紫外-可见分光光度测定法就是分子吸收光谱，属于带光谱。 光互补色 溶液颜色与相应颜色的单色光生成互补色一白光，这种物理现象称之为光互补色。 (2) 朗伯-比耳 (Lambert-Beer) 定律 朗伯-比耳定律，也称之为光吸收定律。在一定的条件下，一束单色光通过吸收介质的溶液后，因吸收介质吸收部分光能，引起该单束光的强度降低。吸收介质的厚度和吸光物质的浓度与光降低的程度成正比。用公式表示： A＝KcL 式中 A——吸光值； K——常数； c——溶液浓度； L——光程。 朗伯-比耳定律同时反映了溶液厚度L和浓度c对光吸收的关系，其数值随光的波长、溶液浓度和溶液的性质变化而变化。 3、分子发生光谱-荧光光谱相关理论 仪器结构与分类 光谱分析仪器的基本构造 凡是用于研究光的吸收、发射和散射的强度与波长关系的仪器，均称之为光谱仪或分光光度