一种基于SARS冠状病毒S蛋白的新型靶向输送生物仿真系统....pptVIP

研究背景 研究背景 研究背景 噬菌体展示技术最初被广泛应用于从复杂的重组文库中筛选和特定靶分子结合的蛋白或多肽。 随着发展，该技术也已经被应用到细胞系、组织和疾病模型水平，筛选和鉴定靶向特定细胞系、组织和疾病模型的结合蛋白和多肽。 目前，恶性肿瘤治疗的关键问题之一就是缺乏特异性攻击肿瘤细胞的有效药物。 噬菌体展示技术已经被用来筛选和表达与不同肿瘤细胞表面的特异性大分子结合的多肽或蛋白，以期将这些蛋白或多肽应用到肿瘤靶向药物的设计中。 BRASIL法（ Biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands ）是一种通过差异离心的方法将细胞-噬菌体复合物从亲水环境分离到疏水性有机相中，从而与未结合细胞的噬菌体分离的过程。 与细胞结合的噬菌体和细胞一起被离心沉淀到有机相中，而未结合的噬菌体仍以可溶形式保存于上层水相中。 该法仅需一步离心分离就可完成，比当前细胞筛选方法更加快速、简单；而且筛选得到的多肽更加敏感和特异。 最常用的有机相是9:1 [v:v]的邻苯二甲酸二丁酯和环己烷。 利用建立的筛选方法，以A549腺癌细胞 为靶细胞，筛选噬菌体随机12肽库 生物信息学聚类阳性克隆，确定靶向肽序列 构建pET-14b-S2-GFP-TP和pET-14b-S2-MKK6-TP质粒 评价蛋白定向输入功能 噬菌体展示是一项筛选技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于病毒粒子内。 噬菌体展示技术的本质就是在一个单一的噬菌体粒子当中遗传基因表型和蛋白表型的直接的对应关系；利用它人们可以将各种自然界存在或不存在的DNA整合到噬菌体基因中，以重组蛋白的形式表达在噬菌体表面，从中筛选出人们所需的目的片断。 随着这项技术的发展，作为外源基因表达的载体已经从最初丝状噬菌体M13（左边两个）拓展到了λ噬菌体（右边一个）、T7噬菌体、酵母和细菌，所插入的外源基因片断也包括了小肽基因、抗体片断基因、蛋白基因和cDNA文库等。 外源蛋白融合于噬菌体的不同外壳蛋白表达的拷贝数不同，高拷贝表达（左边第一个，黄色蛋白）利于筛选低亲和结合肽的筛选，而低拷贝（中间，黄色蛋白）利于高亲和力结合肽的筛选 结合-洗脱-扩增为噬菌体展示技术最经典和最简单快速的淘选（panning）程序。将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。将被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合-洗脱-扩增循环，以富集那些可结合序列。经过3－4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。 噬菌体展示技术最初被广泛应运于从复杂的重组文库中筛选和特定靶分子结合的蛋白或多肽。 随着发展，该技术也已经被应运到细胞系、组织和疾病模型水平，筛选和鉴定靶向特定细胞系、组织和疾病模型的结合蛋白和多肽。 目前，肿瘤治疗的关键问题之一就是缺乏特异性攻击肿瘤细胞的有效药物。 噬菌体展示技术已经被用来筛选与表达于不同肿瘤细胞表面的特异性大分子结合的多肽或蛋白，以期将这些蛋白或多肽应用到肿瘤靶向药物的设计中。 鉴于以下两点，一是SARS冠状病毒S2蛋白具有介导细胞融合的特征，二是噬菌体展示技术又能够筛选达到靶向肿瘤细胞的多肽和结合蛋白，我们拟通过以下实验流程实现我们的生物仿真靶向输送系统。 我们的实验流程是：以培养的人肺腺癌A549细胞为靶细胞，利用噬菌体展示技术筛选随机12肽库，获得阳性克隆，将阳性克隆进行生物信息学聚类，获取阳性克隆的保守特征，确定至少三条的保守靶向多肽； 同时分离SARS冠状病毒S基因的S2片段，并将其克隆入具有HIS标签的原核载体pET-14b中，构建pET-14b-S2质粒 。 将确定的靶向多肽基因分别构建到pET-14b-S2中，形成pET-14b-S2-TP质粒。 将绿色荧光蛋白基因（GFP）和MKK6活性诱变体MKK6(E)基因分别克隆入pET-14b-S2-TP质粒，形成pET-14b-S2-GFP-TP质粒和pET-14b-S2-MKK6-TP质粒，然后表达纯化蛋白，进行蛋白定向输入功能的评价。 我们的靶向输送系统的设计理念就是：通过以上的筛选和构建，获得如下两类蛋白，一类是靶向肺肿瘤细胞的结合多肽、S2蛋白和GFP三个蛋白形成的一个融合蛋白，一类是靶向肺肿瘤细胞的结合多肽、S2蛋白和可诱导细胞凋亡的MKK6（E）形成的一个融合蛋白，来实现靶向多肽和S2蛋白将外原蛋白[GFP或MKK6（E）]靶向到肺癌A594细胞并携带外原蛋白进入细胞的目的。 该靶向输送系统中融合蛋白后接绿色荧光蛋白（green fluoresence protein，GFP），可在荧