基因操作原理Principles of Gene Manipulation.ppt

第一节 Maxam-Gilbert DNA 化学降解法 Reagents for MG DNA sequencing 平台效应 plateau effect 在PCR反应后期,产物的积累按减弱的指数速率增长(一般已积累到0.3～1pmol产物) 原因: 底物浓度降低， dNTP or Primers dNTP or enzyme的稳定性 末端产物抑制(pyrophosphate焦磷酸, dsDNA) 非特异性竞争(非特异性产物or primer-dimer) 特异性产自身复性(10-8M) 高浓度产物下,变性不彻底. 避免出现背景 5．反应液的配制 (1) 常规 最后加酶,及矿物油 (2) 具3’-5’活性酶 A:template, primer, dNTP H2O B:buf enzyme H2O (3) 热起始 下层:dNTP buf primer 中间:蜡珠(Ampli Wax PCR Qam100) 上层: template (Taq) ·先加下层液,再一粒蜡株,70℃ 10min 5℃ 5min ·迅速加30?l上层混合物 四、PCR介导的克隆 (一)添加限制性酶切位点 1.引物的设计 (引入酶切位点） 切点的类型 优先8 base序列, 如AscI NotI PacI, PmeI, SfiI, SrfI 若内部序列为已知, 则可根据需要进行设计 切点的位置 参见限制性内切酶部分 如EcoRI, 5’端有一个C，在2hr内可切割?90% HindIII 5’端有3个C 在2hr内可切割?10% 20hr内可切割?75% 2．综合处理 (当酶切位点在最末端时) Kinase 处理，在5’端加一个磷酸 Klenow补平 Ligase连接成多聚体 酶切，回收目标DNA片段 （二）A/T克隆法 1. PCR产物：Taq poly 产物的3’末端 一般要在3’末端加一个核苷酸, 通常为A （Vent, Pwo, Pfu等的产物为平末端） 2.载体 pGEM-T, pGEM-T Easy (promega) pCR-3, pCR-II, pCR-3-Uni (半磷酸化)(Invitrogen) 核心 线性DNA ·末端转移酶加ddTMP ·产生单个T的限制性内切酶 如MboII, XcmI, HphI, HphI, GGTGA(8/7) MobII, GAAGA(8/7) ·Taq DNA poly +高浓度dTTP （三）平端克隆法 用于克隆具3’→5’外切活性的DNApoly扩增的PCR产物 ·pCR Script (stratagene) 类似pBlue script MSC:NofI SrfI, BamHI, SmaI, PstI, EcoRI, EcoRV H3 SrfI:GCCC↓GGGC SmaI,CCC↓GGGC ·pCR Script SrfI （四）不需要连接反应的克隆方法 1．UDG克隆法 UDG酶是参与TTP生物合成的一种酶，水解脱氧核糖与尿嘧啶之间的N-糖苷键,产生脱碱基的dU,从而破坏DNA的碱基配对 2．外切法 3．PCR介导的亚克隆 （五）反向PCR (inverse PCR) 略 （六）长片段的PCR克隆 许多公司开发出一些用于扩增长片段的反应体系 多用混合酶(如Pwo, Pfu) 来扩增 Taq Pwo Long sys 0.9kb 1.1kb 2.9 4.8 6.3 科学出版社 C.W.迪芬巴赫 /G.S德维克斯勒，1998 C．W．Dieflenbach/G.S.Dueksler 五、PCR介导的诱变 (一) PCR随机突变 每循环Taq错配率在0.1～2×10-4之间。 20-25cycles后，每个核苷酸产生的累积错误率达10-3,但对于构建一个具有不同序列的变异库仍然不够，特别是1kb的片段。 原因：在普通条件下，具较大定向错配即AT对变GC对 设计出一种致突变PCR法，使错误率达7×10-3，且无倾向性。 ① Mg2+→7mM ② Mn2+→0.5mM ③ 提高dCTT/dTTT到1?M，促进错误掺入 ④ 提高Taq酶量，促进延伸链在碱基错配位置继续延伸 DNA shuffling, DNA 改组,