细胞生物学实验材料.doc

细胞生物学与细胞工程实验室 目 录 实验一 荧光显微镜的原理和使用 实验二 叶绿体的分离与荧光观察 实验三 线粒体的活体染色与观察 实验四 细胞膜的通透性 实验五 DNA的细胞化学——Feulgen反应 实验六 植物染色体标本的制备和观察 实验七 细胞计数 实验八 植物细胞骨架的光学显微镜观察 实验九 植物原生质体的分离和活性鉴定 实验十 环境因素诱变染色体改组的观察 实验一 荧光显微镜的原理和使用 一、实验目的 了解荧光显微镜的构造及其维护方法；掌握荧光显微镜的使用方法和使用中的注意事项。 二、实验原理 荧光显微镜是选择由高压汞灯或类似光源发出一定波长的激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，观察细胞某种特异成分的分布状态的显微镜。 与普通光学显微镜一样，荧光显微镜也有物镜、目镜、调焦装置、光源、聚光器、载物台、镜身等组成部分。所不同的是，荧光显微镜增加了激发光源和滤片系统，它投射到样品上的是特定波长的激发光而不是普通的可见光。在激发光的作用下，样品中的荧光物质产生发射光（即荧光）。因此，荧光显微镜观察到的是样品中能产生荧光的部分所呈现的荧光映象，普通光学显微镜则是整个样品的可见光透射和折射影像。 某些物质在—定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。 利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。 三、实验用品 荧光显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、解剖刀、0.01%吖啶橙染色液（acridine orange）、蒸馏水、水葫芦叶片 四、实验内容与方法 （一）荧光显微镜的构造 1、基本装置 荧光显微镜的基本装置是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源 、激发滤片、二向色镜和阻断滤片等）的基础上组成的。荧光光源一般采用高压汞灯（50-200W），它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长 ，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断（或压制）滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。 2、光路 荧光显微镜就其光路来分有两种： 　 ① 透射式荧光显微镜：激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。 ② 落射式荧光显微镜：这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个二向色镜，它与光铀呈45°角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，返回到二向色镜，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／二向色镜／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。 （二）荧光显微镜的使用 1、使用方法： 荧光显微镜使用时，一般先用普通的低压光源观察样品，确定了观察的部位后，再切换至激发光观察荧光，如配有照相装置还可进行显微摄影。 ① 接通电源，按压稳压器按钮，使汞灯点亮； ②推上挡光板，滤片转换拨杆调至“O”，打开底座白光光源； ③装片放上载物台，用低倍至高倍白光观察，将需观察的样品置于光圈中央； ④关上底座光源，滤片转换拨杆调至“B”，推开挡光板，观察样品发出的荧光。 2、注意事项： ① 最好在暗室中进行检验。汞灯接通电源后需要10~15 min预热，汞才能充分汽化并形成汞弧，产生高亮度而稳定的激发光。待光源发出强光并稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。 ② 检查时间以一次1~2 h为宜，如果