14-光激发萤光检测法.pptVIP

光激發螢光檢測法 簡介 螢光是一種光放射現象，當一個適當波長的光照射具有螢光性質的分子，分子會吸收光的能量而被激發至高能量狀態，並在極短時間(10-8-10-4秒)內，分子即回復低能量狀態，同時以放光的形式將多餘能量釋出，此即為螢光。依照所使用的激發光源可區分為傳統光源激發螢光及雷射激發螢光兩種。 傳統光源激發螢光(Conventional Lamp Induced Fluorescence) 最早於1981年由Jorgenson和Lukacs提出，當用的傳統光源有汞、氘等電弧燈，首先以濾光片自發射光帶中分離出所需的波長，再經過聚焦來波發分子，產生螢光，由於傳統光源皆為連續波長發射的光源，故必需利用濾光皮或單光器來分離特定的波長，大幅降低激發光的入射光強度而同時也就限偵測的靈敏度質偵測極限一般在10-5-10-8M左右。 雷射激發螢光(Laser Induced Fluorescence, LIF) 與傳統光源比較，以雷射為激發光源的靈敏度較高，因為雷射具有高強度，帶寬窄及同調性的特點，所以容易以透鏡聚焦，其單位面積上的強大能量，能有效提高靈敏度，些種偵測方式稱為雷射激發螢光，文獻上曾報導目前電射激發螢光的最低偵測極限可達10-21mol。 代表性光學光路 -非相干光源CE螢光檢測器 代表性光學光路-共焦型LIF檢測器 代表性光學光路-雷射誘導螢光顯微鏡 代表性光學光路-軸向激發CCD成像檢測的LIF檢測器 激發波長選擇 波長的選擇必須與待測樣品的吸收光譜匹配。如果用同一衍生試劑標記，就可選擇到最佳波長，對常規光源，可用激發濾光片或單色儀來選擇波長，雷射的波長選擇範圍有限，除了可調諧的染料雷射外，一般雷射只輸出固定的一個波長或分立的幾個波長，這是激光光源不足之處。因此，在LIF情況下，就需要從雷射可能輸出波長和化合物衍生試劑的吸收波長兩個方面來考慮，作出恰當的選擇。 樣品的螢光標記 螢光檢測有很高的靈敏度。可惜，大多數物質的螢光量子產額很低，或不發螢光，特別是感興趣的一些生物分子，如氨基酸和多數蛋白質等。因此，需要借助衍生(derivatization)或標記(labeling)技術，對不發螢光的樣品進行螢光標記。 常用的螢光衍生試劑Ⅰ 常用的螢光衍生試劑Ⅱ 螢光背景雜訊及其消除 -螢光背景雜訊的來源 螢光背景雜訊主要來自以下幾個方面： (1) 毛細管壁、非水溶劑及緩衝溶液中的雜質螢光。 (2) 散射光。 (3) 其它。 螢光背景雜訊及其消除 -螢光背景雜訊的消除 (1) 採取浸入式流動池 螢光背景雜訊及其消除 -螢光背景雜訊的消除 (2) 採用鞘流池 螢光背景雜訊及其消除 -螢光背景雜訊的消除(3) 採用時間分辨雷射光誘導螢光檢測 時間分辨雷射誘導螢光 (time-resolved laser-induced fluorescence) 檢測是利用待測螢光和背景光在壽命上的差異進行，分辨測量的一種技術。不同的化合物有不同的螢光發射壽命。如圖所示，利用短脈衝雷射激發後，待短壽命的背景光，如管壁，溶劑和雜質的短壽命螢光衰減到很弱時，打開時間門採樣，這樣就能有效地抗散射以及各種雜質螢光的干擾。 螢光背景雜訊及其消除 -螢光背景雜訊的消除(4) 其它減少螢光背景雜訊的方法 例如，將毛細管斜置放，減少鏡面反射。選擇適宜的毛細管內外徑也是減少螢光背景雜訊的有效方法。 試劑 激發和發射波長 反應物 螢光素異硫氰酸鹽(FITC)(fluorescein isothiocyanate) λex490nm λem519nm 氨基酸、多肽、蛋白質 螢光胺(fluorescamine) λex390nm λem450nm 伯氨基酸 9-芴基甲基氯甲酚酯(FMOC)(9-fluorenylmethyl chloroformate) λex260nm λem305nm ? 鄰苯二醛(OPA)(o-phthaldialdehyde) λex350nm λem450nm 氨基酸、多肽、蛋白質、胺 3-(4-羧基甲酰基)-2奎寧羰醛(CBQCA)[3-(4-carboxybenzoyl)-2-quinoline] λex456nm λem552nm 氨基酸、多肽 萘二醛衍生物(NDA)(naphthalene-2, 3-dicarboxyaldehyde) λex442nm λem490nm ? 4-chloro-7nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazole λex470nm λem530nm 伯胺、仲胺 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid succinimid