8.基因工程药物蛋白的分离纯化与质量控制.ppt

重组基因工程药物的分离纯化及质量控制 A 重组基因工程药物分离纯化方法选择的基因原则 细胞壁的组成和破碎阻力 细胞破碎机理图 常用细胞破碎技术和设备 机械法 机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的. 包括珠磨法,高压匀浆法和超声破碎法 砂磨机 高速珠磨机 高压匀浆器 撞击破碎器 酶解法 是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。酶解法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。 酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，故小规模应用较广. 外加酶法 酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。 溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶， 酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。 外加酶法 有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。 对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。 酶解法的特点 优点： 发生酶解的条件温和 能选择性地释放产物 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整 酶解-自溶作用 自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。 渗透压冲击法 冻融法 化学法: 采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。 酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。 碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。 成本低，反应激烈，不具选择性。 4 蛋白的纯化方法 产 物 特 性 　作 用 等电点 决定离子交换种类及条件 　相对分子量 选择不同孔径的介质 　疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 　生物特异性 决定亲和配基 　溶解性 决定分离体系及蛋白浓度 　稳定性 决定工艺采用温度及流程时间 2、层析分离 仪器设备简介 离子交换全套装置 2.1、吸附法（吸附交换分离法）： 根据吸附机制的不同可分为3种：物理吸附法，羟基磷灰石法和离子交换吸附法；都是利用样品中不同分子与吸附剂之间的吸附和解吸性质不同而达到分离的目的；操作方式有静态吸附和柱层析两种方式；操作过程包括：吸附剂的平衡与活化，加样吸附，洗涤和洗脱。 （1）物理吸附法：常用的吸附剂有硅藻土，活性氧化铝，淀粉和活性炭等；预先洗涤和活化后，在低盐，弱酸或近中性条件下加样吸附，再在弱减条件下进行洗脱。常采用静态方式进行。 （2）羟基磷灰石法： 羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子与蛋白质带相反电荷的基团发生相互作用；也是在低盐和弱酸或中性条件下进行吸附 ；洗脱时提高离子强度；多采用柱层析方式进行。 缓冲液离子组成的选择 ①缓冲液离子的pK值要接近所用的pH， ②采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液， 　　如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐 ③采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液， 　　如：Tris ④缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、溶解度。 缓冲液离子强度的选择 ①起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，一般小于0.1mol/L。 ②洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般0.15mol/L（或采用pH洗脱）。 离子交换拄层析操作方式 一、离子交换剂的处理、转型和再生 二、分离物质的交换 三、物质的洗脱与收集 一、离子交换剂的处理和转型 一般程序：水