798-第一组蛋白质立体结构的测定.pptVIP

第一組蛋白質立體結構的測定 NMR X-Ray CD NMR(nuclear magnetic resonance ) 核磁共振 前言 簡介 約15,000 種蛋白質的三維結構已被解出，80%是用X-ray 解出，20%用NMR 解出 NMR 解出三維結構時不需要長單晶(single crystal)，只要溶在水溶液當中即可，比較符合生物巨分子的生理狀態。 NMR產生訊號的原理 核磁共振儀的射頻器(transmitter)打了一個脈衝(pulse)，將此淨磁化量偏移z 軸，此偏移的磁化量就沿著磁場方向(z 軸)做進動(precession)。造成此磁化量形成陀螺的軌跡，如下頁圖所示。此磁化量的軌跡，會引導一個振盪電流而被記錄下來。 2 .從NMR的peak area 和高度比可知特定原子的數量和原子鍵結的環境。 NMR的光譜分析 一維：H太多 → 訊號複雜 → 難以分析 二維：NOE效應 →可得知原子間的距離 三維：NOE效應+TOCSY技術+NOESY技術  → 旋性、凡得瓦半徑、鍵角  → 輸入computer run出可能的三度結構 〈補充〉NOE 效應 (Nuclear Overhouser Effect) NMR 之所以能解出蛋白質分子在水溶液的三維結構，主要的就是要靠NOE 效應。 NOE＝(I ′ －I0) / I0 I ′為質子對被照射時的intensity I0 為質子對未被照射時的intensity 如果NOE愈強，表示二質子間距離愈短。 NOE 的大小與質子對之間距(γ)的6 次方成反比：NOE ∝ 1 / γ6 NMR的研究領域 一、蛋白質與分子之結合 (Interaction) 利用核磁共振技術我們可輕易地藉由測量化學位移擾動(chemicalshift perturbation)的方式找出protein與ligand 作用的殘基，亦可進一步解出整個complex 的結構。化學位移的擾動主要是因為protein與ligand 結合後某些殘基會和ligand 接觸或作用，而使得化學環境改變，藉由測量各個殘基化學位移的變化情形，便能找出ligand 的結合位置(活性位置)。 二、蛋白質分子之折疊 (Protein Folding) 優缺比較 X-ray 繞射技術§快速且較不受分子量的限制§但是並不是每一種蛋白質都能得到良好的結晶，(蛋白質結晶的取得仍是現今結晶技術的一大挑戰) 核磁共振§找尋蛋白質結構較耗費人力及時間§圖譜分析的工作是既複雜又費時 X-Ray Crystallography 原理:所謂 X-Ray繞射結晶法即是利用X-Ray射向蛋白質晶體使X-ray 產生繞射，經由繞射使照相底片曝光而產生一投影圖形，再將此繞射圖案作分析，作出電子密度圖，經過一連串的計算之後，即可判定出蛋白質的立體結構! Why要使用X-Ray ? 我們採用X 光來決定蛋白質的結構，最大的理由，即是因為X 光的波長10-12-10-8m 恰好近似於蛋白質晶體的晶格大小，因而可以產生繞射，且由於X 光無法聚焦，因此我們必須使用底片曝光法來分析繞射所得的結果。 X 光依形成的方式不同，分成兩種： (1)White radiation: 以經高壓加速之電子撞擊陽極靶標，高速電子受到靶標原子的阻擋，急遽停止下來，其部分動能即以X 光的形式釋出來。以急遽停止電子所產生之X 光與原子之特性無關，而是以連續性不同波長同時出現，其中最短波長取決於撞擊電子的最高能量。如此產生的光譜，亦稱為白光光譜或連續光譜(Continuous X-ray spectrum)。 (2)Monochromatic radiation: 高速電子在撞到原子時，很容易將能量傳遞給原子中的電子，而使原子離子化。當原子內層軌域之電子被激發後，其空出之位置很快會被外層電子的躍入填滿，在此電子躍遷過程中，由於不同軌域間的能階差，X 光會隨著放出；此種過程所產生的X 光與原子中電子軌域之能階有關，因此其波長與原子種類有關，稱之為特性輻射，所形成之光譜則稱為特性光譜(characteristic spectrum)。 蛋白質結晶製備!! X 光繞射結晶法當中很重要的一個條件就是sample 的製備，若是不可結晶，則鐵定不能進行X 光繞射。蛋白質要結晶，首先必須要先大量製備我們所要結晶的蛋白質，因此會裡用載體將記載蛋白質序列的核酸輸入到生產蛋白質的菌體中，如此便可大量製造出純度高的蛋白質，而後氣相擴散法將此蛋白質結晶出來。 結晶方式:用氣相擴散法結晶(Vapor Diffusion Method)，也就是將含有高濃度的