利用琥珀酸为唯一碳源的产谷氨酸菌的研究.doc

【标题】利用琥珀酸为唯一碳源的产谷氨酸菌的研究 【作者】周 永 强 【关键词】琥珀酸　碳源??谷氨酸　诱变选育 【指导老师】王 庆 【专业】生物科学 【正文】1?引言目前我国谷氨酸的年产量位居世界首位[1]。据统计，2007年达到191.29万吨[2]。此外，谷氨酸在医药、食品、人造制革、化妆品工业及农业上也具有广泛的用途。研究谷氨酸的生产对我国有重大而深远的影响，对提高国际竞争力具有十分重要的意义。优良生产菌种的选育一直是谷氨酸发酵的主要研究课题[3]。自1957年木下、朝井等人创立发酵法生产谷氨酸以来，迄今已有50年的历史。经各国科学家的不懈努力，在全世界已建立了完整的谷氨酸生产体系。对于利用微生物进行工业发酵来说，完全可以在不改变现有生产设备的情况下，通过改变微生物菌种来大幅度提高谷氨酸的产量和质量。?我国利用发酵法生产谷氨酸始于1964年。中国科学院微生物研究所相继从自然界筛选出两株北京棒杆菌和钝齿棒杆菌，该两株菌株在我国味精生产厂家的推广应用，有力地推动了我国又一新型发酵工业——味精工业的崛起[4]。经过三十余年的努力，我国味精工业谷氨酸生产菌的选育取得了显著的成绩，其发展过程大致可分为二个阶段，60年代中期至70年代初期大规模筛选阶段，从自然界筛选出了一批谷氨酸高产菌株。70年代初期至今为遗传育种阶段，将野生株谷氨酸生产菌进行有目的地定向改造，选育出了许多优于其亲株的高产株。在谷氨酸生产过程中，进行谷氨酸生产菌的选育是为了提高产酸率和转化率，简化生产工艺流程，防止噬菌体污染轮换使用菌种?[4]。谷氨酸生产菌主要有四个属，而我国筛选的野生株只有棒杆菌属和短杆菌属两个属，还没有筛选出小杆菌属和节杆菌属的高产菌株。在两个属中也仅有北京棒杆菌、天津棒杆菌、钝齿棒杆菌及它们的诱变菌株，菌株数量只有少量的几十种，而日本的谷氨酸生产菌株多达近千种。我国谷氨酸生产菌基因资源还相当贫乏，给现代菌种选育工作带来困难。因此，还必须从自然生境中开展大规模的筛选谷氨酸生产菌工作。我国谷氨酸生产菌的产酸率和糖酸转化率与国外先进水平还有较大的差距，已成为我国提高味精工业经济效益、降低成本的瓶颈。在谷氨酸产生菌的筛选工作中仍有许多地方有待改善，以提高其谷氨酸生产效率和转化率[5]。根据谷氨酸代谢的调控网络分析，可通过增加前体物质的合成、切断或者减弱支路代谢，来提高谷氨酸的产量[6]。周盛、李家洲、武波经化学诱变,通过改变谷氨酸棒杆菌B1的代谢途径,筛选出以甘油、琥珀酰CoA和乙醛酸为碳源的营养缺陷型，产酸率和转化率分别比出发菌株高18.1%和12.7%。选育营养突变型菌株可有效提高谷氨酸生物合成的能力,提高产酸率。营养缺陷型突变型菌株选育是通过诱发突变,阻断或弱化一些有关途径,以利谷氨酸的有效积累[7]。陈碧娥，王丽娜以北京棒杆菌Q272为出发菌株,经紫外线诱变,筛选能以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生长良好的菌株,强化CO2固定反应，产酸率和转化率分别比出发菌株提高1.45%和9.1%?[8]。邱玉棠等利用UV?线、氯化锂、香豆素等多因子复合诱变和高温驯化,?选育出琥珀酸、生物素营养双缺陷型的耐高糖、耐高谷氨酸且温度适应范围大(32℃-48℃)?的突变菌株GMH?-908，简化了生产工艺[9]。虽然有大量科研工作者对谷氨酸生产菌进行了研究，但是目前的选育工作还在以北京棒杆菌、天津棒杆菌和钝齿棒杆菌为基础的研究，所以筛选更多类型的谷氨酸生产菌株，扩大谷氨酸生产菌基因资源的工作仍任重而道远。?谷氨酸发酵，目的是积累谷氨酸。当微生物细胞中因某种理化因素诱变阻断了α-?酮戊二酸到琥珀酰CoA和乙醛酸两条代谢途径时,?微生物的三羧酸循环只能沿着谷氨酸代谢方向合成,当细胞内的琥珀酸量增加时可以强化CO2的固定[10]。本实验的目的是为了筛选出能利用琥珀酸为唯一碳源的高产谷氨酸菌种。因此，本课题对谷氨酸生产菌选育的一个重要指标—－筛选能利用琥珀酸进行CO2固定产生谷氨酸的菌种。2?材料及仪器2.1?样品来源实验所用菌种由重庆市涪陵区长江师范学院生物实验中心微生物实验提供。2.2?主要仪器与设备表2-1?实验主要仪器一览表仪器名称 型号 生产厂家全自动新型生化培养箱 ZSD—1090 上海智城分析仪器制造有限公司座式自动电热蒸汽灭菌器 ZDX—35BI型 上海申安医疗器械厂有限公司电热鼓风干燥箱 CS101—2EBN 重庆恒达仪器厂电子天平 MP5002 上海恒平科学仪器有限公司电子分析天平 AB204—L 梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司万用电炉 DL—1 北京中兴伟业仪器有限公司冷藏冷冻箱 BCD—208G 青岛海尔股份有限公司双层特大容量全温度恒温培养振荡器 ZHWY—2112B 上海智城分析