重组人锰超氧化物歧化酶的抗肿瘤作用研究.doc

重组人锰超氧化物歧化酶的抗肿瘤作用研究 陈车生1，庞怀宇2，李素霞2，袁勤生2* 1上海富海科申药业有限公司RPMI-1640培养基美国GIBCO公司小牛血清杭州四季青物工程公司MTT，美国Sigma公司PI/RNase Staining Buffer ，美国Becton Dickinson公司AnnexinV-EGFP双染试剂盒南京凯基生物科技发展有限公司10 mg/瓶，批号：060705浙江海正药业股份有限公司羊抗人多克隆抗体多克隆抗体羊抗人多克隆抗体Santa Cruz 公司；IRDyeTM800结合二抗，美国Rockland Inc；SP试剂盒北京中杉金桥公司18-22g，雌雄各半，由中国药科大学动物室提供； 2 实验方法 2.1 rhMn-SOD单用及与环磷酰胺（CTX） ml。接种后24 h称鼠重，并随机分为9组，每组10只，雌雄各半。实验设：对照组，（2 mg/kg AD），剂量分别与AD 2 mg/kg联用剂量分别与mg/kg联用。小鼠给药，每天次，停药后处死荷瘤小鼠，分离瘤块称重，：对照组，剂量分别与mg/kg联用。小鼠给药，每天次，停药后处死荷瘤小鼠，分离瘤块称重，取ICR小鼠10只，按移植性肿瘤研究法，接种S180实体瘤接种24后称鼠重，并随机分为10组：对照组，AD组（2 mg/kg），4个剂量组（/kg rhMnSOD），4个剂量组(上述剂量分别与AD 2 mg/kg联用)。小鼠给药，每天次，停药后处死荷瘤小鼠，分离瘤块称重， 抑瘤率＝（1－给药组平均瘤重/空白对照组平均瘤重）×100% 增效率＝（1－联合给药组抑瘤率/阳性对照组抑瘤率）×100% 2.3.2组织病理学检查 上述动物实验结束后，处死小鼠取出移植瘤，瘤块瘤块经10%甲醛溶液固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片（4 μm厚），hematoxylin and eosin，HE）染色，根据病变轻重程度不同，依次标记为“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”表示，其中“-”为无明显改变，“++++”为严重的病理改变。组织切片于系列二甲苯中浸泡脱蜡后，1 mm3左右组织块。匀浆后离心收集上清液，测定蛋白含量，SDS及蛋白电转移，电转后的硝酸纤维素膜免疫杂交检测靶蛋白。 3 实验结果及分析 3.1 rhMn-SOD单用及与环磷酰胺（CTX）、阿霉素（ADR）合用对小鼠移植瘤EAC的抑制作用 与对照相比，所有用药组对EAC肿瘤的生长具有显著的抑制作用。单用rhMnSOD对EAC肿瘤的生长具有显著的抑制作用，且抑制作用随rhMnSOD剂量的增加而增强。与CTX组相比，rhMnSOD两个剂量与CTX合用均没有增效作用。rhMnSOD与ADR合用有增效作用，与ADR组相比，15000U/kg rhMnSOD剂量的联合用药组的增效作用具有统计学意义（P0.05）。实验期间所有的动物存活且无明显行为异常。 3.2 rhMnSOD单用及与CTX合用对小鼠移植瘤S180的抑制作用 与对照相比，所有用药组对S180肿瘤的生长具有显著的抑制作用。单用rhMnSOD对S180肿瘤的生长具有显著的抑制作用，且抑制作用随rhMnSOD剂量的增加而增强。与CTX组相比，rhMnSOD 5个剂量与CTX合用均没有增效作用。 3.3 rhMnSOD与ADR合用的抗肿瘤作用 3.3.1 rhMnSOD与ADR合用对小鼠移植瘤S180的抑制作用 与对照相比，rhMnSOD对S180肿瘤的生长具有显著的抑制作用，且抑制作用随rhMnSOD剂量的增加而增强。实验期间所有的小鼠均存活切无行为异常，给药组和对照组相比，体重和白细胞计数结果均无明显差异。 与对照组相比，所有联合用药组对肿瘤生长都具有显著抑制作用（P0.01），且抑制作用随rhMnSOD剂量的增加而增强。与ADR组相比，除2 mg/kg rhMnSOD联合用药组对肿瘤生长抑制没有明显增效外，其余三个用药组均有增效作用，且8 mg/kg和16 mg/kg rhMnSOD剂量的两个联合用药组的增效作用具有统计学意义（P0.01）。 3.3.2 小鼠S180移植瘤的组织病理学检查 病理学检查，对照组中，肿瘤细胞分裂增殖旺盛，细胞密度很高，病理性核分裂经常可见，肿瘤组织边缘光滑；而rhMnSOD单用组和联合用药组的肿瘤细胞分裂增殖被抑制，细胞密度降低，肿瘤细胞核物质浓缩，部分肿瘤细胞呈坏死状，肿瘤组织边缘有淋巴细胞浸润。这些变化随rhMnSOD给药剂量的增加而增强，联合用药组的变化比相同rhMnSOD剂量单用组的变化更明显。 3.3.3 CD4+与CD8+的表达分析 为探讨rhMnSOD的抗肿瘤作用机制，我们根据组织病理学检查中发现淋巴细胞浸润这一现象，对肿瘤组织进行了免疫组化分析。与对照组相比，单用rhMnSOD或rh