ERα调节剂高通量筛选模型的建立.doc

ERα调节剂高通量筛选模型的建立 张倩1 郑智慧2 路新华2范玉玲2水小溪1 赵宝华1 张华2 贺建功2 （1.河北师范大学 生命科学学院 河北 石家庄 050016 2.华北制药集团新药开发有限责任公司 河北 石家庄 050013） 摘要: 目的 建立一个基于哺乳动物单杂交的报告基因的细胞瞬时转染的ER调节剂高通量筛选模型。方法 利用RT-PCR 技术从脂肪的总RNA 中扩增ERα基因配体结合区（ligand bingding domain ERα LBD)序列,构建表达载体pBind-ERα的嵌合表达载体。与含GAL4相应元件的报告质粒共转染细胞系,通过检测荧光素酶基因的表达状况评价化合物对ERα的调节活性。结果 成功构建pBind-ERα表达质粒，并且通过报告质粒与表达质粒之间的比例和宿主细胞条件的优化,得到了最佳的共转染条件。在该模型上激动剂阳性药雌二醇能剂量依赖地提高荧光素酶的表达,最大上调倍增数超过25倍；拮抗剂阳性药它莫昔芬能有效地拮抗雌二醇的活性，最大拮抗活性可达8倍。此外该模型被微量化为384孔板。结论 ER调节剂的筛选模型灵敏、稳定,可以快速进行多种来源的化合物药物的筛选。 关键词　ERα, 激动剂,拮抗剂，共转染, 高通量筛选 ABSTRACT: OBJECTIVE Estrogen Receptor (ER) are a member of superfamily of ligand-activated transcription factors which play critical roles in many biological processes， to screen the modulator of Estrogen Receptor alpha for mechanism research and drugs development, a high-throughput screening model of Estrogen receptor alpha modulator based on the Transient transfection was established. METHODS ERα LBD gene was obtained by RT-PCR, and subcloned to p GEM-T easy Vector for sequence, then the ERα LBD fragment was excised by restriction enzymes and inserted into pBind promoter Vector to construct expression vector pBind -ERα LBD. The vector pBind -ERα LBD was transiently cotransfected with pGl3-Gal4 into L02 cell to assay the expression levels of luciferase. RESULTS After optimizing, an ERα LBD modulator screening model was established successfully. Estradiol and Tamoxifen could induce the expression of luciferase in a dose-dependent manner. CONCLUSION This method can be used for high-throughput screening for the modulator of ERα. KEY WORDS: ERα, agonist, antagonist, cotransfection, high-throughput screening 雌激素受体 (Estrogen Receptor ER)是类固醇激素受体超家族的成员之一，是一种配体依赖性转录因子,它与雌激素特异性结合,通过雌激素应答元件( EREs) 来调节基因的转录[1]。人类ER(hER) 有两种亚型,即ERα和ERβ, 在人体的中枢神经系统、血管、乳腺、子宫、骨、肺、肾、肠、卵巢、前列腺、膀胱[2]等部位均有表达。ERα是ER家族中表达比较广泛的一个亚型，而且它的转录活性也大于ERβ[3] 。ER 配基即调节剂可分为3类：激动剂、拮抗剂、选择性雌激素受体调节剂( selective estrogen receptor modulator SERM)，主要用于治疗骨质疏松症[4, 5]、乳腺癌[6,7,8 ,9]等等，并逐渐成为大家关注的药物靶点