雷公藤多苷片高效液相指纹图谱的研究.doc

雷公藤多苷片高效液相指纹图谱的研究 杨春欣，梁 健，沈 熊，吕迁州 （复旦大学附属中山医院药剂科药学研究室，上海 200032） 摘要：目的 雷公藤多苷片有抗炎及抑制细胞免疫和体液免疫等作用是治疗类风湿性关节炎、肾病综合征等自身免疫性疾病的药建立雷公藤多苷片的指纹图谱,全面而有效地控制雷公藤多苷片的质量雷公藤多苷片采用高效液相色谱法Diomonisl C18分析柱检测波长为218nm柱温为35℃以水-乙腈为流动相1.0mL·min-1 的流速梯度冼脱雷公藤多苷片指纹图谱指纹图谱的方法有较好的重现性、精密度和稳定性HPLC指纹图谱，为衡量其质量优劣提供了依据。结论 利用雷公藤多苷片HPLC指纹图谱可以较好地反映雷公藤多苷片的内在质量，且该方法简便，快速，有效，灵敏，有助于雷公藤多苷片的质量控制。 关键词：高效液相色谱法指纹图谱雷公藤多苷片雷公藤内酯醇 雷公藤多苷片是卫矛科（Celastraceae）雷公藤属雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f. )的干燥去皮根经提取、纯化后得到的有效组分。雷公藤多苷片与其它雷公藤制剂相比具有用量小,不良反应少等优点[1]，雷公藤多苷片广泛应用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、白塞氏三联征、麻风、自身免疫性肝炎及皮肤病等疾病，疗效显著，其生理活性是由二萜内酯、生物碱、三萜等多种成分协同产生[2]。雷公藤多苷片是目前临床上使用较多的非甾体类免疫抑制剂。 目前国内雷公藤多苷片至今还没有很完善的质量控制标准,仅对雷公藤内酯醇或雷公藤内酯甲进行控制[3,4,5]，以至不同厂家的产品存在不同程度的差异，为了准确地控制雷公藤多苷片中有效成分群的含量，建立雷公藤多苷片的指纹图谱[6]，对其临床用药的有效性和安全性有很大的意义。 1 仪器与材料 Gillson　高效液相色谱仪系统，包括：306型泵，119紫外/可见光检测器，715色谱处理系统，Rheodyne 9125型进样阀，配以20 μL采样环，805测压仪，811C动态混合器，Gilson818柱温箱。EYELA旋转蒸发仪N1001型 （日本东京理化器械株式会社）。B2500S-MTH型超声波清洗仪（上海必能信超声有限公司）。AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。雷公藤多苷片A～H共8个批号（上海复旦复华制药厂和江苏泰州美通制药厂）；雷公藤内酯醇对照品,含量99.53%,雷公藤内酯甲，含量99.17%，均购自上海科卫医疗技术研究所。中性氧化铝，上海五四化学试剂厂孔径0.45μ上海半岛实业有限公司净化器材厂色谱纯 .1 供试品溶液的制备：采用均匀取样法从雷公藤多苷片取出15片，研细成粉，精密称取400mg，置于25mL三角烧瓶中，加入20mL乙酸乙酯，超声提取30min，过滤，滤液过15 g中性氧化铝柱，用30mL乙酸乙酯洗脱，收集全部过柱后的洗脱液，回收乙酸乙酯，得残存物，加1.5mL乙腈溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。 2.2 雷公藤内酯醇对照品溶液的制备：精密称取干燥恒重的雷公藤内酯醇对照品0.00081g，用乙腈溶解并定容在10mL容量瓶中，制成浓度为0.081mg·mL-1对照品溶液，备用。 2.3 色谱条件：色谱柱:Dikma公司Diamonisl C18 (250 mm×4.6mm,5μm)；流动相: 水（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～70min，A： 65%～0%，B：35%～100%；流速:1.0mL·min-1 ，检测波长: 218nm；柱温:35℃；进样体积:20μL。 2.4 指纹图谱方法学建立与考察 2.4.1检测波长的比较： 本实验选择了210，215，218，219，225nm五个波长进行测定，结果在波长218nm下出现的色谱峰数目适中，内参物雷公藤内酯醇的色谱峰完整，且基线平稳，故选择218nm作为雷公藤多苷片HPLC指纹图谱的检测波长。 2.4.2不同流动相及洗脱方法的比较：采用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等不同流动相进行等度或梯度洗脱，结果发现含有磷酸的流动相并不能改变峰型。采用梯度洗脱, 可兼得二者的优点。见表1。 表在下雷公藤内酯醇的保留时间和峰面积较稳定与相邻其他色谱峰分离较好其各色谱峰之间的分离效果也较好且基线平稳各峰峰形也较好故最终选择作为高效液相的流动相.4.4稳定性试验： 取雷公藤多苷片样品A的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12h进样测定。以雷公藤内酯醇为内参比峰，计算各共有峰的色谱相对保留时间和相对峰面积。结果显示，18个共有峰的色谱相对保留时间的RSD均小于0.56%、相对峰面积的RSD均小于5.67%。 2.4.5精密度试验： 取雷公藤多苷片样品B的供试品溶液，连续进样5次，计算各共有峰的色谱相对保留时间和相对峰面积。结果18个共有峰的色