依博素生物合成基因ste15的克隆表达及酶学性质研究01.doc

依博素生物合成基因ste15的克隆表达及酶学性质研究 李晓华 李 元 (中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所北京 100050) 摘 要： ste15的酶学性质。方法 将ste15基因克隆至质粒pET30a，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达SDS结果显示在大约50kD处出现了一条新的蛋白条带，与推测值相符。Ste15蛋白在E.coli中以可溶和包涵体两种形式表达，二者各占50％镍亲和柱层析纯化。Stel5蛋白是葡萄糖糖基转移酶，负责依博素中葡萄糖多糖重复单元增长链的转移。 关键词：链霉菌，表达，依博素生物合成糖基转移酶(Streptomyces. sp.139)产生的可能用于治疗类风湿性关节炎的I类新药，正在申报临床[1]。依博素由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖和半乳糖糖醛酸共8种单糖组成[2]。依博素生物合成基因簇ste已被，其中ste15基因的大小为1,269bp，编码一个422-aa的蛋白[3]。同源性比较表明其编码产物的C端（217-369aa）含有类似pfam00534的结构域，属于糖基转移酶家族1，该家族的糖基转移酶催化UDP、ADP、GDP 或 CMP 连接的活化糖基转移至作用底物，包括糖原，6-磷酸果糖，脂多糖。本室通过基因同源重组双交换获得基因缺失变株，与依博素相比，产生的多糖衍生物EPS-15m，葡萄糖组分消失（3.9％→0％），遗传互补株ste15c产生的多糖衍生物EPS-15c，葡萄糖组分得到一定恢复（0％→1.08％）[4]，由此推测ste15基因可能编码葡萄糖糖基转移酶，参与依博素的生物合成。本文对ste15基因进行了克隆和表达，用为葡萄糖糖基转移酶，负责依博素中葡萄糖多糖重复单元增长链的转移。1 材料和方法 1.1 ste15基因的克隆和表达 以S.sp.139总DNA为模板，以5-GTTCCATGGTCATGCACGTCATGGTGG-3 (NcoI)和5-GGCAAGCTTTCATCTGTTTCCCCCATCC-3 (HindIII)为引物，进行PCR反应，反应条件为：95℃ 3min；94℃ 45s，50℃ 50s，72℃1min，共30个循环；72℃ 10min。扩增的片段与pET30a质粒相连，转化至E.coli BL21(DE3)受体菌，获得转化子。转化子提取质粒后进行酶切鉴定，含预期片段的重组质粒命名为pET30a-Ste15，重组菌株命名为BL21/pET30a-te15，并进行序列测定。将BL21/pET30a-te15 按1％接种于含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养至DD600约0.4时，加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，诱导4h后，收集菌体。 1.2 重组Ste15蛋白的纯化 将诱导表达后的菌体以5ml/g悬浮于预冷的1×Binding Buffer (50mmol/L NaH2PO4,300mmol/L NaC1，10mmol/L imidazole，pH 8.0)中，置冰浴进行超声破碎，10,000rpm离心收集上清液，45μm滤膜过滤后与Ni2+-NTA His·Bind Resins 4℃结合过夜。将蛋白上清液镍亲和柱依次加入15ml 1×Washing Buffer（60mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl）洗涤杂蛋白，5ml Eluting Buffer（0.5mol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl）洗脱目的蛋白，流速为8min/ml。分管收集洗脱液，进行SDS分析。 1.3 ste15 阻断株细胞膜的提取 链霉菌原生质体的制备按照Kieser等的方法进行[5]。1L ste15基因缺失变株菌体的原生质悬浮于适量PTC buffer中[Sucrose 10.3%, CaCl2(2H2O 0.386%,MgCl2(6H2O 0.204%, K2SO4 0.025%, TES buffer (0.25 mol/L, pH7.2) 8%(v/v), Trace element solution 0.2%(v/v)]，冻融3次使细胞裂解。细胞裂解液3300×g离心10min，取上清离103000×g ) 30min取沉淀，用68% sucrose(w/w) 和 20mM potassium phosphate(pH7.8) 溶解，至终体积2.5ml， 上2ml 42% sucrose(w/w) ，197000×g离心90min.收集的褐色部分用20mM potassium phosphate(pH7.8)溶解至蔗糖终浓度约10%，125000×g离心30min，收集沉淀即为细胞膜，用100μl 0.25M sucro