1.2基因工程的基本操作程序--gao.ppt

2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 将目的基因导入细胞 农杆菌转化法（感染双子叶植物和裸子植物，对大多单子叶植物没有感染力） 基因枪法（常用于单子叶植物） 花粉管通道法（转基因抗虫棉） 将目的基因导入动物细胞 显微注射技术（“超级小鼠”） 将目的基因导入微生物细胞 导入大肠杆菌的方法：先用钙离子处理，使其转为感受态细胞。再将重组载体与感受态细胞混合。 * * 一、目的基因的获取 基因组：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。 基因文库: 1、人工合成：基因小，序列已知（DNA合成仪） （1）基因组文库提取法 目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。 2、从基因文库中获取目的基因(目的基因序列未知) 人DNA 限制性内切酶 DNA片段 DNA片段插入载体 重组DNA分子 质粒转化大肠杆菌 基因组文库 （2）cDNA文库提取法 cDNA： 经逆转录合成的、与RNA互补的DNA。 cDNA文库：以mRNA作为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补DNA，适当载体连接转入受体菌。 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 ①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。 ：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 编码区 非编码区 原核细胞的基因结构 ②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。 启动子 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 真核细胞的 基因结构 编码区 非编码区 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 ：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。 非编码序列： 包括非编码区和内含子 基因文库 依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性 从基因文库中得到目的基因的方法 K. Mullis 3、利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增目的基因（目的基因序列是已知的情况） ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.前提条件： ②原理：__________ ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 多聚酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 利用PCR技术扩增目的基因 聚合酶链式反应（PCR） 变性、退火、延伸三步曲 ?变性：双链DNA解链成为单链DNA ?退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 ?延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 过程： a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 定量PCR仪 SRX-481型全自动基因扩增仪(PCR) 1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 (二)基因表达载体的构建 3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 二、基因表达载体的构建 作用：使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以 遗传给后代，使目的基因表达并发挥作用。 启动子：位于基因的首端，