免疫学原理★第11章生物素-亲合素放大技术.ppt

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第十一章 生物素-亲合素放大技术 第一节 生物素的理化性质与标记 一、活化生物素 二、活化生物素标记蛋白质 第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记  一、理化特性  二、亲合素(或链酶亲合素)的标记 第三节 生物素-亲合素系统的特点 一、灵敏度 二、特异性 三、稳定性 四、适用性 五、其他 思考题 小结 第四节 生物素-亲合素系统的应用 一、生物素-亲合素系统基本类型及原理 二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用 三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用 四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用 五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用 第一节 生物素理化性质与标记 一、活化生物素 生物素侧链的末 端羧基经化学修 饰后制成带各种 活性基团的衍生 物-活化生物素 (生物素化衍生物) 生物素活化 活化生物素 标记蛋白质醛基的活化生物素 生物素酰肼(BHZ):水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) :生物素与赖氨酸连接 后,再与无水肼反应而成。 除醛基外, BCHZ还可标记氨基 标记蛋白质巯基的活化生物素 马来酰亚胺-丙酰-生物胞素(MPB) 能特异地与蛋白质巯基结合的活化 生物素 标记核酸的活化生物素 光生物素(photobiotin) 侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香 基硝基苯,可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B-核酸探针 二、生物素标记蛋白质 活化生物素通过侧链与蛋白分子连接; 一个蛋白分子可被多个生物素标记-多价性; 对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记微酸性抗原; 抗原、抗体标记后活性不变; 可对标记材料(如酶)标记:碱性磷酸酶标记后 活性将降低; 选择活化生物素:依抗原或抗体分子所带可标记基团 的种类(氨基、醛基或巯基)以及分子的酸碱性; 控制生物素:蛋白质比例 生物素:IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度 0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag,3~5个/Ab; 使用交联臂减少空间阻力 第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记    亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物。而且,二者均为大分子蛋白,因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素(AV)或链酶亲合素(SA)结合。 二、亲合素/链霉亲合素标记 标记物:酶、胶体金 异硫氰酸荧光素(FITC) HRP-AV(SA) 过碘酸钠、戊二醛 ABC/SABC 预制AV(SAV)-Biotin 第三节 生物素-亲合素系统的特点 一、灵敏度 二、特异性 三、稳定性 四、适用性 五、其他 第四节 生物素-亲合素系统的应用    生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强,各自均可以与各型大小分子结合,以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性,使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中,尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。 一、生物素-亲合素系统基本类型及原理 BAB法: Ag+B·Ab Ag-Ab·B A Ag-Ab·B-A B·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点:以游离A分别连接B-Ab和B-E BA法 Ag+B·Ab Ag-Ab·B A·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点:以A-E/SA-E代替BAB法中的A,省 却了加B-E的步骤 3. ABC法  ⑴ A+B·E A- B·E----ABC ⑵ Ag+B·Ab Ag-Ab·B ABC Ag-Ab·B-ABC 特点:将BAB法中的A先与B-E结合,制备成复合物ABC 二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用 BAS在ELISA中的应用 生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定 三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用 BAS用于荧光抗体技术,通常采用BA法,即用荧光素直接标记亲合素(或链酶亲合素);也可采用游离亲合素(或链酶亲合素)搭桥,两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素(BAB法)或荧光标记的抗亲合素(或链酶亲合素)抗体的夹心法。 四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用 BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶联,用于对终反应的放大(BA法) BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离 五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用 以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因

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