基因启动子分析.pdf

基因启动子分析 一：克隆目的基因基本启动子序列 我们都知道，基因的基本启动子一般是在基因转录起始位点上游，当一个基因在没 有确定其转录起始位点的时候，我们假定NCBI上提交的序列就是他的完整转录本， 那么他的第一个碱基就是他的转录起始位点。而基因的基本启动子一般就是在转录 起始位点的上游2000bp左右和下游200bp左右，当然,这个是一般情况,具体问题还 要具体分析.尤其现在发现一般的基因都是有几个转录起始位点的. 我们通过该基因mRNA序列和基因组序列BLAST，就能够在染色体上找到这段基因组 序列。我这里用human的AGGF1基因做个例子给大家具体演示一下. 1 首先需要在NCBI里面查找到AGGF1基因的mRNA序列,这个我想大家都应该很清楚, 如下图. 2 然后就是用这段mRNA序列和人类的基因组序列BLAST 3 BLAST得到了很多结果，我们往往选择最上面那个最匹配的结果。 4 点击之后就可以看到下图，这个基因的14个外显子和13个内含子在5号染色体上 的位置一目了然，第一个外显子在上面，说明这个基因在染色体上是正向的，基本 启动子就应该在第一外显子上面，我用红色的方框标明了。 5 大家有没有注意到左上方有个数据框，我把数值改为76,360K 到 76,362.200 , 刚好2200BP,包括了第一个外显子的前200BP左右. 然后点击红色框标明的Download/view sequence. 6 然后就到了这个界面, Sequence Format 选择GenBank, 然后点击 Display. 就 得到我们所需要的序列了. 7 这里我们可以看到1989到2201是AGGF1的mRNA序列,说明我们的确找到了该基因 5非翻译区的上游启动子序列.建议将这2200bp都克隆下来. 以上的步骤就是基因基本启动子的查找,其实还有很多调控序列是在基因内含子区 域或者是基因的3非翻译区等,序列查找的步骤和上面是一样的. 8 还有一个方法更加简单,那就是用AGGF1的 前60bp序列和nucleotide 数据库 BLAST,可以得到该序列在染色体上的位置,需要注意的是,如果是反向的序列的话, 我们就要选择反向互补的序列. 二：软件预测顺式作用元件，做点突变分析 得到这些序列后,克隆进没有启动子载体pGL3或者pTAL-luc中去，转染细胞, 测定 荧光活性，如果有很强的活性,那么说明你已经成功克隆到了该基因的基本启动子. 然后可以通过5 ‘非翻译区一系列的缺失突变，不断把范围缩小,找到哪一段序列对 于该基因的启动子活性是必须的或者是最重要的。 当找到这个比较核心的启动子序列后，可以通过一些在线的软件去预测其顺式作用 元件的位点,,每个在线软件都有自己独特的算法分析,得到的结果并不都是可靠的, 每个软件都有自己的优势，需要多综合一些软件预测的结果,并通过分析预测出来 的转录因子是不是和该基因有功能上的联系等做进一步的选择，继续做下面的验证 实验。 下面这两个有商业化的软件： http://www.genomatix.de/ /pub/databases.html#transfac 下面这两个是免费： http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html /cgi-bin/tess/tess 用TESS举个列，直接在首页下面的方框里输入你要分析的序列就可以了。 同样在首页，通过下面的方框，你可以查找一些转录因子的相关信息. 了解转录因子结合DNA的保守序列