纳米金-适配体.doc

基于纳米金粒子的适配体-肽相互作用的亲合力分析 摘要：本研究用纳米金做比色探针和荧光淬灭剂，对核酸适配体与它的目标物粘蛋白1肽之间的亲合力进行分析。当该适配体的目标物存在时，纳米金上的适配体DNA对纳米金的稳定性增加，这是由于ssDNA-肽复合物可以为纳米金提供更强的空间保护作用。随着纳米金的紫外-可见光吸收光谱的消失和CY5-ssDNA荧光的恢复，ssDNA-肽-纳米金复合物已经形成，ssDNA序列的解离常数也被确定了。出了测紫外-可见光谱、荧光光谱以外，有不同包被的纳米金颗粒的直径、电势、透射电镜图像也支撑了这个实验原理。这个实验提供了一种快速、灵敏的方法来确认通过指数富集法一步步得到的具有高亲合力的配体。 关键字：单链DNA适配体 粘蛋白1肽 纳米金 亲合力相互作用 比色法 荧光 前言：核酸适配体是一种像抗体一样能以高亲合力与它们的目标物相结合的一种寡核苷酸序列，单链DNA或RNA。当通过SELEX技术筛选到数百种核酸适配体序列以后，就必须快速有效的对适配体的亲合力进行评估。目前，有许多评估单链DNA或RNA适配体对它们各种目标物（包括蛋白质、小分子）的亲和性的方法。这些技术包括毛细管电泳、表面等立体共振光谱、基于亲和柱的方法，这些技术都需要昂贵的仪器或者冗长的固定探针。 除了这些技术，纳米金粒子也被广泛的用于色度法传感器，通过控制纳米金的聚集与分散来检测生物分子结合和生物进程。惰性金属纳米粒（如金、银）可以发生局域表面等离子体共振。直径13nm的纳米金粒子由于发生局域表面等离子体共振而在520nm波长处吸收可见光，然后呈现出红色的胶体溶液状。纳米金的聚集会干扰局域表面等离子体共振，使得紫外-可见吸收光谱发生红移，胶体溶液因聚集程度的不同而变为紫色、蓝色或灰色的悬液。 单链DNA能够完全地吸附在纳米金上，因此在盐溶液中可以稳定纳米金，然而双链DNA和有立体结构的DNA（单链DNA结合在目标物上形成的）不能稳定纳米金。这个差异性就可以用于比色测定来检测DNA序列或DNA结合的目标分子。在Nacl溶液中检测凝血酶、卡那霉素、钾离子时，具有与目标物高亲合力的ssDNA被吸附到纳米金表面从而保护纳米金不发生聚集。当盐溶液中有靶分子存在时，由于适配体-靶分子复合物的形成，适配体从纳米金表面解离下来，静电保护作用被除掉，纳米金发生聚集。已经很少利用单链DNA和有立体结构的DNA对纳米金所起的保护作用的这个差异，来检测肽了，但是依然被用于检测小分子。 纳米金除了粒子间的距离能决定其耦合性外，它还能淬灭与其接近的荧光染料通过纳米金属表面能量转移。当荧光染料光子激发光谱与纳米金的局域表面等离子体共振带发生重叠时，这是一个取决于距离的荧光淬灭。纳米金淬灭荧光的能力被用于传感各种小分子，研究RNA折叠机制，检测DNA中单个的错配碱基。当荧光染料分子与纳米金表面的距离增加时，荧光就可以恢复。 因此利用纳米金的局域表面等离子体共振和纳米金属表面能量转移这些性质，我们设计了一个实验，这个实验可以方便地确定一个适配体对其目标物的亲合力大小。这是实验用一个40肽以及对它有不同亲合力的适配体来做模型样品。用大多数的人类腺癌细胞来大量表达粘蛋白1肽，它与癌症的预测有关。这个研究是建立在这些基础上的，随着覆盖有ssDNA的纳米金的稳定增加，CY5被淬灭的荧光得到恢复。通过相应的纳米金颜色的变化以及荧光的发射，来测定ssDNA–肽复合体的形成以及它们结合的亲合力。实验前没有必要将ssDNA共价固定在纳米金上，实验只需要数分钟就可以完成。为了便于理解，首先要做的工作就是注释说明，ssDNA锚定靶分子后从纳米金表面解离下来不是这个基于纳米金的实验所必须具备的前提条件；ssDNA–肽复合体形成后保留在纳米金表面，用这个性质来检测小分子或者研究它们的相互作用也具有相同的灵敏度。 实验材料与方法 材料：HAuCl4·3H2O (99.99%) 、柠檬酸三钠(99.9%)（购于Sigma Aldrich公司）。粘蛋白1肽， PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA（GL Biochem公司合成）、适配体ssDNA S1.3, 5’ -GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3’（对 MUC1具有高亲合力）、适配体ssDNA S1.1, 5’ -TAAGAACAGGGCGTCGTGTTACGAG-3’)（对 MUC1具有较低的亲合力）、25 个碱基的的 ssDNA核酸适配体库、它们所对应的在C6位修饰有CY5的适配体，由Singapore公司合成。 纳米金的制备： HAuCl4 经柠檬酸钠还原法得到纳米金，在纳米金的形成过程中，柠檬酸阴离子既有还原作用又有稳定作用。过量的柠檬酸通过在纳米金表面形成多层不同氧化状态的离子层