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基因工程整理资料 概论 重组 DNA 技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然 后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新 性状的DNA 体外操作程序，也称为分子克隆技术。 基因工程:指重组 DNA 技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成 部分。 基因工程的安全隐患 1. 对环境的影响 2. 新型病毒的出现 3. 癌症扩散 4. 人造生 物扩散 重组 DNA 技术与基因工程的基本用途：分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资 源；大规模生产生物活性物质；设计、构建生物的新性状甚至新物种 基因工程诞生的理论基础 ：1 . DNA 是遗传物质 2. DNA 双螺旋结构3. 中心法则和遗 传密码 基因工程的支撑技术：核酸凝胶电泳技术 ，核酸分子杂交技术 ，细菌转化转染技术， DNA 序列分析技术，寡核苷酸合成技术，基因定点突变技术，聚合酶链反应（PCR ） 技术 限制性内切酶：是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp ）， 并由此处切割DNA 双链的核酸内切酶。 *活性:如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 Ⅱs 型限制性内切酶 :在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA 双链。 连接酶： DNA 的连接条件 （1）必须是两条双链DNA。 （2 ）DNA3’端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P） （3 ）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：NAD+ 连接反应的机理 1. ATP （NAD+)提供激活的AMP 2. ATP 与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi 3. AMP 与连接酶的赖氨酸-氨基相连 4. AMP 随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA 一条链的5‘端P 上，形成“DNA-腺苷 酸”复合物 5. 3‘-OH 对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP 两种 DNA 连接酶 （1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端 （2 ）T4 噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端 影响连接反应的因素 1. 插入片段与载体的浓度比例 2. 反应温度 一般14~16℃ DNA 聚合酶 基因工程中常用的 DNA 聚合酶 1.大肠杆菌DNA 聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA 聚合酶 4. T4 DNA 聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA 聚合酶 6. 逆转录酶 常用的DNA 聚合酶的特点 共同特点：把dNTP 连续地加到引物的3’—OH 端。 主要区别 ：持续合成能力和外切酶活性不同。 各聚合酶的性质： DNA 聚合酶 3’5’外切 5’3’外切酶活性 酶活性 大肠杆菌DNA 聚合酶 低 有 Klenow fragment 低 无 T4DNA 聚合酶 高 无 T7DNA 聚合酶 高 无 化学修饰T7DNA 聚合酶 低 无 遗传修饰T7DNA 聚合酶 无 无 逆转录酶 无 无 Taq DNA 聚合酶 无 有 DNA 聚合酶I （Pol I）的反应条件 ① 底物： dNTPs （dATP、dGTP、dCTP、dTTP ） ② Mg2+ ③ 带有3’—OH 游离端的引物 ④ DNA 模板 核酸探针：能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核苷酸分子 放射性标记的优缺点 优点： 制