2.常规病理检查.ppt

常规组织病理学技术 组织固定 目的： 保持组织和细胞的形态学特征，防止因为酶活性或微生物而使组织坏死，自溶及腐败。 保持组织和细胞中可溶性成分不被溶解。 减少蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞成分丢失。 维持细胞膜，内质网，核膜等细胞结构的完整。 组织固定 目的： 使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。 固定剂兼有硬化作用，使组织硬化增加组织硬度，便于制片。 防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 经过固定的组织，能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辩认。 组织固定 固定的机制和原理有很多种，包括: 反应基团间的共价结合 交联的共价结合 脱水与酸性物质作用 盐的形成和热能 共同作用 组织固定 理想的固定剂： 保留蛋白，mRNA以及DNA的生化特征。 支持组织化学染色，免疫组化，原位杂交和各种其他技术。 能快速渗透和固定组织。 适合各种不同的组织和不同大小标本的固定。 固定剂易于回收和处理，价格合理。 无毒，无害，无可燃性。 组织固定 固定剂的种类： 1、按照化学性质分类 Ⅰ类：醛类：甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。 Ⅱ类：氧化剂类：四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。 Ⅲ类：蛋白变性类：甲醇，乙醇，醋酸等 Ⅳ类：其他：氯化汞，苦味酸等 。 2、按照成分分类： 单一固定液：如甲醛，酒精，醋酸，锇酸，丙酮等 混合固定液：中性甲醛，AF液等 组织固定 常用的固定方法 蒸汽固定法：甲醛或锇酸可产生蒸汽。用于保存可溶性成分；小而薄的组织，冷冻干燥组织 灌注固定法：肺，肾脏，肝脏等 细胞涂片的固定：浸入法和滴加法，浸入法应注意相互污染的问题 微波固定法：微波加热可缩短固定时间，但时间和温度掌握困难 常用固定液介绍 甲醛（分子式:HCHO）固定: 纯甲醛是一种蒸汽 溶于水后成为37%~40%的甲醛溶液（又称福尔马林溶液） 固定液为10%的中性福尔马林（即约含4%W/V的甲醛溶液） 甲醛在水溶液中形成HOCH2OH（亚甲基氢氧化合物）复合物 甲醛（分子式:HCHO）固定: 甲醛的亚甲基氢氧化合物能与蛋白质末端多种不同的功能基团结合，使蛋白多肽分子间形成桥键，使蛋白质不再发生改变，保存原位。 - 甲醛（分子式:HCHO）固定的优点: 组织形态结构保存好 固定均匀，穿透性强 组织收缩少 增加组织硬度，便于切片 价格便宜 甲醛（分子式:HCHO）固定的缺点: 封闭抗原决定簇： 醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象发生改变，可能部分和完全遮盖抗原决定簇，使之不能完全暴露，导致免疫组织化学染色产生假阴性。 处理措施： 固定后能够充分水洗，可减少分子间交联。 抗原修复还可使抗原再现。 缩短固定时间(8～24小时)，降低固定温度(4℃)可减少交联。 甲醛（分子式:HCHO）固定的缺点: 甲醛内杂质含量多，影响酶染色 含甲酸，固定液酸化，影响染色 产生甲醛颗粒，影响观察，尤以多血的肝，脾组织常见 易挥发，污染环境 10%中性缓冲福尔马林固定液： 100ml40%福尔马林 900ml蒸馏水 NaH2PO4 4g Na2HPO4 6.5g 最常用的固定液，抗原保存好，合适免疫组化染色。 优点：--保存组织中易溶于水的物质，如尿酸结晶和糖原---常与其他试剂配制成多种混合固定液：加快固定时兼有脱水的作用缺点：--可溶解脂类物质，要求保留脂类物质时不能使用酒精--对组织收缩较大，单纯酒精固定组织收缩明显，变硬变脆，制片困难--渗透力差，组织表面已固定，组织中间固定不佳--沉淀核蛋白，球蛋白，白蛋白，影响核染色--价格贵 醋酸（Ａcetic acid）固定--对染色质固定较好。---对脂肪、糖元不能固定。-- 能使组织膨胀，可抵偿因乙醇、升汞、甲醛等固定液引起的组织收缩和硬化，故常配成5%混合固定液。-- 穿透速度最快，固定时间短。-- 5％醋酸的pＨ值在2≈8，此时可停止细菌和酶的活动，可防止组织自溶变性。 --能沉淀蛋白质，它不能固定脂肪、类脂和糖类。--穿透力较弱，单独使用可使组织收缩。多与醋酸和铬盐（重铬酸钾）配成混合固定液。--固定后细胞的结构，特别是核的细微结构显示清晰。--易产生汞盐的沉着，损害切片刀，因此染色前必须脱汞。 --能沉淀蛋白质，但对脂肪和类脂无固定作用。--穿透力很慢，细胞收缩显著，但不会使组织硬化。--有软化皮肤的作用，配制的Bouin氏液对头皮及全身皮肤制片效果甚好。--固定时间太久会影响HE染色。--糖元较好的固定剂。 --可以作固定剂，又可