白细胞基因组DNA00.doc

血中DNA的提取血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料，在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA。因此，从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一，破坏红细胞，通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异，先使红细胞裂解，经离心后收集白细胞；第二，白细胞裂解：使膜蛋白和核蛋白变性，游离DNA，通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三，除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质，使DNA留在上清液中；第四，在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出。取材 取外周血5ml，EDTA抗凝1.新鲜抗凝血，离心弃去上清液； 2.取出4冰箱预冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml细胞压积加入6-10ml裂解液），轻轻吹打混匀；红细胞裂解液ELS配方：NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml;Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌,用时加10-20ml 3.rpm离心分钟，离心弃去上层红色清液； 4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次； 5.如裂解不完全可重复步骤2和3； 氯仿方法提取DNA在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。? ?原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。．20% SDS ．mg/ml蛋白酶K ．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿1）、氯仿．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．白细胞处理 取红细胞裂解完全后收集的沉淀，加入0.5ml TE 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。 加20% SDS 25 μl，蛋白酶K (mg/ml) 25 μl，混匀。 60°C水浴1-3hr。（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。2. 离心×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。3. 加等体积饱和酚，混匀，离心×10min，取上层水相到另一管中。4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心×10min，取上层水相到另一管中。6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7. 待絮状物出现后，离心×5min，弃上清液。8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心×3min ，弃上清液。9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加TE溶解过夜。(三）DNA定量和电泳检测1.DNA定量：? ?DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260 读数×稀释倍数/1000。? ?DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。2.电泳检测：? 取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。 三、注意事项1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。 DNA提取过程中各种试剂的作用及原理1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪