单克隆抗体及应用.ppt

（5）浆细胞/瘤细胞杂交瘤细胞：可以生长 HAT培养液中氨甲蝶呤阻止 DNA合成； 但其含有HGPRT、TK酶，可通过旁路途径合成DNA (3)筛选：培养过程中加入HAT培养液，培养14天，存活细胞为杂交瘤细胞。 构建成功的嵌合抗体 抗乳腺癌 1986 抗结肠癌 1987 抗肺癌 1987 抗CEA（癌胚抗原） 1989 抗HBsAg 1990（我国） 抗T表面受体 BMAO31-IgG 1991（我国） （2）嵌合抗体优点： a.免疫原性低，有利于用于人体 b.在人体内半衰期较鼠单抗长 c.在人体内生物学作用（如CDC、ADCC）较鼠单抗强 d.与人/人杂交瘤比，体外传代更稳定 (3) 嵌合抗体制备流程：（不用记） a.提取能产生McAb杂交瘤细胞的DNA、RNA、mRNA b.建立基因文库：分纯轻、重链V区基因 c.测轻、重链V区基因DNA序列 d.与人Ig轻、重链C区基因及表达载体连接，构成嵌合基因 e.导入受体细胞表达，并筛选 f.产物鉴定 2.重构抗体（Reshaped Antibody) 在嵌合抗体基础上发展而来，使嵌合抗体进一步“人化” 以人Ig基因为框架，去掉高变区部分，用鼠单抗高变区基因连接上，构成重构基因，导入受体细胞表达出的抗体。 研究表明，Ig的氨基酸序列在重、轻链各有三个高变区（与抗原结合的部位）： 重链（共450 a a）；N端31~37、51~68、84~91 轻链（共214 a a）：N端26~32、48~55、90~95 重构基因：绿色为人Ig基因（框架），红色为鼠McAb基因（高变区部位基因） 重构抗体：所有绿色部分均为人源，红色部分为鼠源（CDR） 红色为编码鼠单抗高变区的基因 绿色部分为 人Ig的基因 重构基因 重构抗体 * * 单克隆抗体及应用 (monoclonal antibody, McAb or mAb) 一.概述 克隆：无性繁殖的细胞株 单克隆：由一个细胞无性繁殖而来的一个细胞株（一团细胞），其中所有细胞特性完全一样 （一）单克隆抗体： 针对Ag分子表面某一抗原决定簇（又称表位）而产生的抗体分子，称McAb。 单克隆抗体——由一个B细胞克隆产生的识别单一抗原表位的同源抗体。 （二）产生 1. 1975年Kohler and Milstein首 创用杂交瘤技术成功制备McAb 2.80年代初用基因工程成功制备McAb （三）制备McAb的方法 1.杂交瘤技术 2.基因工程技术 二. 杂交瘤技术制备单克隆抗体 （一）杂交瘤(hibrydoma)技术 制备单克隆抗体的原理 B细胞（浆） 瘤细胞 杂交瘤 细 胞 杂 交 分泌 单克隆抗体 杂交瘤技术制备单抗原理 B细胞：能产生抗体的小鼠B(浆)细胞 瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞 Hybrid cell 1.B细胞(浆细胞）特点： 1)能产生抗体 2)但不能在体外长期培养 3)细胞内含HGPRT酶（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶）和TK酶（胸腺嘧啶核苷激酶），可通过旁路途径合成DNA 2.骨髓瘤细胞 1)能在体外长期培养 2)不含HGPRT和TK酶 3.杂交瘤细胞具有以上两种细胞的共性： 既能产生抗体、在体外能长期培养；同时含有HGPRT和TK酶，可通过旁路途径合成DNA 4.HAT培养液筛选出杂交瘤细胞 (次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）： 氨基蝶呤是抗代谢的药物，能阻断内源性合成DNA（合成DNA的主要途径）。 那么，HAT培养液是如何选出杂交瘤细胞呢 氨甲蝶呤（叶酸拮抗剂） 阻止 合成 DNA 杂交瘤细胞（含HGPRT、TK) 经旁路途径 合成 DNA B细胞、瘤细胞杂交后，经HAT培养液培养数日后，五种细胞的存活情况： （1） B细胞：自然死亡（不能在体外长期培养） （2）瘤细胞：HAT培养液（氨甲蝶呤）阻止细胞合成DNA；同时无HGPRT、TK酶，不能通过旁路途径合成DNA，故死亡 （3）B/B杂交细胞：自然死亡[同（1）] （4）瘤/瘤杂交细胞：死亡[同（2）] （二）杂交瘤技术制备McAb的简要步骤 1.制备能产生单抗的杂交瘤细胞 2.克隆化杂交瘤细胞 3.筛选杂交瘤细胞 4.扩大培养单克隆杂交瘤细胞