基因敲除动物模型与比较医学1.ppt

基因敲除概述 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。 基因敲除定义 中文名称：基因敲除 英文名称：gene knock-out; gene knockout 定义：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。广义的基因敲除包括某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。常用同源重组的方法。敲除基因用以观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。 ａ．ES细胞的获得　 ｂ．基因载体构建 ｃ．将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源 的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源目标基因组中从而得以使目标基因缺失。 ｄ．用选择性培养基筛选已击中的细胞 　　 ｅ．通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。在嵌和体小鼠之间交配产生纯合性基因敲除小鼠。 由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠 条件性基因敲除法：利用Cre／LoxP或FLP/FRT实现靶基因的切除 条件性基因敲除的基因重组及切除步骤 需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白 基因捕获法的基本原理图 如被敲除的是具有致命功能的基因，则小鼠将在胚胎早期死亡，如发生致命的出血。 在长大的基因敲除小鼠体内，各基因功能往往组成网络，互相交织，某些基因具有多种功能。 被敲除基因的功能可以被其他基因的功能代偿，使其表型的改变模糊而难以分析。 Page ? * 大连医科大学 实验动物中心 比较医学教研室 王爱国 第四章 生物高新技术在比较医学研究中的应用普通楼 225室 wangaiguotl@ 第一部分 转基因、基因敲除动物技术与比较医学 第二部分 克隆动物技术与比较医学 第三部分 胚胎工程技术与比较医学 主要内容 第一部分 转基因、基因敲除动物技术与比较医学 第一节 转基因动物技术 第三节 基因敲除动物技术 第二节 转基因动物技术在比较医学研究中的应用 第四节 基因敲除动物技术在比较医学研究中的应用 第三节 基因敲除动物技术 2007诺贝尔生理学医学奖获得者 英国人马丁·埃文斯、美国人马里奥·卡佩基和奥利弗·史密斯（从左至右），因为他们在改造活体内特定基因的“基因靶向”技术等方面做出的奠基性贡献，而共同获此殊荣。 培育基因靶向性敲除小鼠的主要步骤 Mansur的正负选择系统 基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 四环素诱导的基因敲除过程示例图 第四节 基因敲除动物技术在比较医学研究中的应用 1. 遗传病中的应用 2. 心血管病中的应用 3. 肿瘤病等中的应用 4. 人类器官移植中的应用 5. 免疫学中的应用 1. 遗传病中的应用 糖尿病、高血压病、肥胖等多基因遗传病是由于遗传因素和环境因素共同作用的结果。我们对它们的认识还处于一种朦胧状态。 一、可以在活体内分析单个候选基因的作用，也就是将复杂的问题分解开来，分别对单一因素进行分析。 二、可以在活体内对多个候选基因以及环境因素的相互作用进行综合分析，也就是把多种因素集中于同一个体进行综合分析。 这两点是其他任何研究体系都做不到的。 2. 心血管病中的应用 敲除小鼠LDL（低密度脂蛋白）接受器基因，这种基因的缺乏，导致人在临床上早期易患心脏病，血浆中LDL和胆固醇的浓度增高，当基因敲除小鼠饲喂与人营养水平相似时，引起与人临床相似的症状。 3. 肿瘤病等中的应用 敲除癌基因或抑癌基因，并施加外部刺激，观察肿瘤的发生发展，将更加深入的研究癌基因或抑癌基因的功能。 4. 人类器官移植中的应用 问题： 一、器官来源。目前器官来源主要是尸体，受到时间和运输条件的限制，在有些地方还涉及宗教的问题。 二、器官移植的排斥反应，目前要找到与受体血清型完全匹配的器官可能性很小，临床上只能靠药物来抑制排斥反应。 基因敲除动物模型可能会解决这两个难题。 5. 免疫学中的应用 近年来，随着基因敲除动物模型的出现，在免疫学方面出现了几十种免疫分子基因敲除的动物模型，将免疫学研究，特别是免疫耐受的研究推到一个新的阶段。 MHC I和II类抗原基因敲除后，小鼠缺乏CD4+