生物工程专业毕业论文--强冬性小麦抗冻蛋白基因IRI的克隆及表达研究.docVIP

目 录 中文摘要（关键词） 1 外文摘要（关键词） 1 前言 2 第一章 强冬性小麦IRI基因的克隆4 1材料与方法 5 1.1实验材料 5 1.1.1植物材料 5 1.1.2处理方法 5 1.1.3菌种和相关质粒 5 1.1.4试剂5 1.1.5生物软件 6 1.1.6所用到的仪器6 1.1.7所用到的引物7 1.2实验方法 7 1.2.1小麦总RNA提取 7 1.2.2反转录合成第一链cDNA 7 1.2.3IRI基因全长的扩增 8 1.3结果与分析 9 1.3.1小麦叶片总RNA的提取 10 1.3.2IRI基因的分离 10 1.3.3氨基酸序列比对11 1.4讨论12 第二章 IRI基因的原核表达 13 2.1材料和方法 13 2.1.1菌种和载体 13 2.1.2 酶和试剂 13 2.1.3 pET30a-IRI表达载体的构建及转化 13 2.1.4 IRI蛋白的原核表达 17 2.1.5 SDS电泳分析 17 2.2结果与分析 17 2.2.1目的片段PCR产物结果17 2.2.2 PET30a载体小提结果 18 2.2.3 pET30a-IRI重组表达质粒的鉴定结果18 2.2.3.1菌落PCR结果 18 2.2.3.2酶切鉴定结果 18 2.2.4重组质粒pET30a-IRI在BL21(DE3)中的诱导表达 19 2.3讨论 19 第三章 转基因载体的构建 21 3.1材料和方法 21 3.1.1研究材料 21 3.1.2实验方法 21 3.2结果与分析 24 3.2.1引物PCR扩增结果 24 3.2.2分步双酶切结果 .24 3.2.2.1 NCO I单酶切结果 24 3.2.2.2BstE II单酶切结果 25 3.2.3重组PCAMBIA1301-IRI转入DH5α中，菌落PCR结果25 3.3讨论 25 结论 27 参考文献 28 致谢 30 摘 要 小麦（Triticum aestivum L.）是全球种植面积最大的粮食作物之一。小麦的抗寒力是限制小麦产量的主要因素之一。因此研究小麦的抗寒机理，对于提高小麦的抗寒力有着重要的理论意义。本文以强冬性小麦M808为试验材料，从低温诱导的小麦幼苗叶片中克隆出IRI基因的全长编码区并对其进行后续原核表达以及转基因研究。 1.以抗寒力较强的M808为试验材料，设计简并引物，通过RT-PCR方法，从低温处理的M808幼苗叶片中克隆出4条小麦IRI基因全长序列，分别被命名为 TaIRI3、TaIRI4、TaIRI5、TaIRI6，其中TaIRI3、TaIRI4的序列长度均为 867 bp，编码 288 个氨基酸；TaIRI5、TaIRI6 的序列长度均为 858 bp，编码 285 个氨基酸。TaIRI5和TaIRI6与来源于小麦的TaIRI1基因和大麦的一个IRI基因亲缘关系较近，而TaIRI3、TaIRI4与TaIRI5、TaIRI6亲缘关系关系相对较远。 2. 将IRI基因插入pET-30a表达载体合适位点，获得了pET-30a-IRI大肠杆菌表达载体。转BL21大肠杆菌菌株，经37 ℃，1mM IPTG诱导IRI融合蛋白的表达。 3. 构建转基因载体，将IRI基因插入到PCAMBIA1301载体合适位置，为下一步通过转基因进行IRI基因功能研究奠定了基础。 关键词：小麦；抗寒力；抗冻蛋白；基因克隆；体外表达 Abstract Wheat (Triticum aestivum L.) is one of the largest crop cultivation areas in the world and cold hardiness of wheat is one of the restrictive factors of crop improvement. Therefore, it has important theoretical significance for studying the cold hardiness of wheat to improve the cold hardiness of wheat. In this study we chose winterness wheat M808 as materials，IRI full-length genes are cloned from wheat seedlings during cold acclimation can be used to construct the IRI gene recombinant and to induce the expression of IRI protein and genetic transformation research