花生种质资源的cp SSR分析.pptVIP

花生种质资源 cpSS分析 摘 要 SSR为简单序列重复（Simple SequenceRepeat），又称微卫星体（Microsatellit），是由1-5个核苷酸组成的短序列（又称核心序列或主题序列）首尾相连重复多次构成的DNA。 SSR作为第二代基于PCR的一种新型DNA分子遗传标记，具有数量丰富、多态性高、重复性好、分布于整个基因组、特异位点扩增、发生频率高、共显性遗传等特征，在果树育种中具有极大的应用价值和开发潜力。本文主要系统分析不同花生种的细胞质基因组遗传差异,来对不同花生品种的叶绿体的遗传多样性进行比较分析。本文课题主要包括三大方面的类容，其一是对所提供的花生提取其DNA，并将其稀释。另外则是对30对引物进行筛选，通过琼脂糖凝胶电泳来选择扩增后具有差异条带的引物，然后再用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测所选引物的准确性。由此可以排列在接下来的实验中引物的先后使用顺序。最后则是用所选择的引物对花生DNA进行扩增。最终结果是有四对引物扩增出稳定的多态性条带，8对引物扩增不全，其余效果较差，特别是引物顺序越靠后越差。 * 资源 1.1 花生的重要意义 花生是世界范围内广泛栽培的重要油料和经济作物之一，是发展中国家重要的食用植物油脂和蛋白质来源。中国是世界上最大的花生生产、消费和出口国。在国内农作物中，花生的种植面积位于第７，但单位面积产值位于第５。因此，花生生产的发展对于弥补我国植物油脂和蛋白质供给的不足、调整农业结构、发展农村经济等方面均具有重要意义。 1.2 研究目的意义 叶绿体基因组相当保守，其进化速率比核基因组慢得多，但叶绿体DNA的保守性并非绝对，在较多植物类群中都有不同程度的cpDNA种内变异。叶绿体SSR是近年来发展起来的一种新型的分子标记技术，由于其具有SSR标记的优点又兼顾到叶绿体基因组的特点，所以目前广泛用于植物群体遗传分析及系统发育分析研究。迄今为止，还未见cp SSR 在花生上报道。本研究通过cp SSR对花生资源的扩增检测，旨在探讨花生cp SSR的多态性及cp SSR用于花生重要性状的分子标记、遗传图谱构建、遗传多样性分析上的潜力。 2.1 种子发芽与取样 将28份花生种子按表1 进行编号，每种挑选6粒将其放入培养皿中，在培养皿上编上相应的号码，向培养皿中加入适量的蒸馏水并将其放置于37℃的培养箱中，每天浇一次水。大约一周后待花生叶片张到适当的量后将花生叶片收集于朔料袋中，在塑料料袋上编上相应的号码并将其放入-70℃的冰箱中保存。 2.2 花生基因组DNA的提取 1.取叶片100-200mg,用液氮速冻后，迅速研成粉末，至于2.0ml离心管内，加入800ul 1×CTAB提取缓冲液和1ul B-巯基乙醇（0.1%-0.3%），1×CTAB提取液需预热到60℃。 2.60-65℃水浴预热1.5h，中间每隔一段时间颠倒混匀。 3.冷却至室温，加入等体积（大约800ul） 仿：异戊醇（24：1，v/v）,轻轻颠倒混匀，常温下10000r/min离心15min，离心后取上清液。 4.加入等体积的1×CTAB提取缓冲液，混匀后离心，常温14000r/min下离心10min，离心后取上清液，（若上清液浑浊，增加上步骤一次）。 5.加入等体积异戊醇，轻轻混匀，沉淀DNA，-20℃下沉淀30min。 6.挑出DNA，用70%乙醇简单冲洗一次，常温下70醇再洗涤2h. 7.常温干燥DNA。用200ulddH2O或1×TE溶解，（可将DNA至于50℃温浴助溶）。 8.在10000r/min下离心5min,取上清液，加入2ulRNaseA(10mg/ml),在37℃下保温1-2h，最后放入-70℃的冰箱中保存。 9. DNA的稀释。用移液枪移取5ul所提取的DNA放入小离心管中，然后加入75ul的双蒸水，混匀后测其浓度，然后根据所得浓度值计算出要配制25ng/ulDNA稀释液所需要的DNA量，然后量取并稀释，最后将稀释液放入-70℃的冰箱中保存。 2.3 引物筛选和PCR扩增 2.3.1 引物的稀释 根据David等（2005）提供的引物序列，由金斯特公司合成。将装有引物的离心管在高速离心机10000r/min下离心1min,然后按照离心管壁上的说明要求将引物稀释，混匀后放入-20℃的冰箱中保存. 2.3.2 PCR体系的配置 按下表配置反应体系，反应混合液配好后混匀，然后将混合液分装于PCR板中，最后盖上密封盖，低速离心1min。 3 DNA 0.6 Primer_R 0.6 Primer_F 12.8 0.2 Poly Taq polymerase 76.8 1.2 2.5 mM dNTPS 76.8 1.2 25