布鲁氏菌试管凝集试验.ppt

布鲁氏菌血清学检验 山西省疾病预防控制中心 张秋香  免疫学基础   由于布鲁氏菌培养的营养条件苛刻而且时间长，所以布鲁氏菌的血清学诊断越来越受到重视。 主要是根据相应抗原抗体可以在体外发生特异性结合并呈现可见反应的原理,用已知抗原(或抗体)检测体液中未知的抗体(或抗原).由于试验时通常是用患者血清作为待检材料,所以检测抗原抗体的体外试验又称为血清学试验或血清学反应. 血清学检查既可协助早期诊断，还可确定是否复发或重复感染。 感染1-2周后，患者血清中出现IgM抗体，可以用凝集试验或抗人球蛋白试验检测． 感染３周后，患者血清中出现IgG抗体，可以用补体结合试验，荧光抗体或ELISA检测． 虎红平板的凝集反应（RBPT） 原理 该试验又称为班氏孟加拉红平板凝集试验。由于所用的抗原是酸性（PH3.6—3.9）带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性、检查出的抗体是IgG类，因此提高了该项反应的特异性。 器材与试剂 虎红平板凝集抗原、被检血清、清洁脱脂玻片或有凹形孔的玻片、0.1ml吸管或微量加样器、混合棒或牙签 试验方法 在玻片上加0.03ml被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03ml，充分混匀，在5分钟内观察结果。 (四) 结果判定 有二种方法，第一种是，出现可见的凝集反应就判为阳性； 另一种用“+”表示凝集程度按下列标准用加号记录反应强度： ++++：出现大的凝聚片或小的粒状物，液体完全透明，100%凝集 +++：有明显的凝聚片，液体几乎完全透明，75%凝集 ++：有可见的凝集片，液体不甚透明，50%凝集 +：液体混浊，只有少量粒状物，25%凝集 -：液体均匀混浊 评价 此法简便、快速、容易操作，适于基层大面积检疫； 此法有一定敏感性，检查牛的阳性率稍高于绵羊、山羊。 因为在酸性环境下IgM活性受抑，该法主要是检查IgG类凝集抗体，所以特异性较好，与补体结合试验、二巯基乙醇（2-ME）试验和抗球蛋白（Coomb’s0）试验有较高的吻合率。 该法受制备抗原时条件影响较大，所以每批制备抗原应予以检查、标化方可应用。  试管凝集试验 试管凝集试验的原理1897年莱特氏等(Wright)与其同事发现患该病的病人血清与马尔他细菌的培养物产生了凝集现象，遂称之为莱特氏凝集反应，成了迄今常用的血清学诊断方法之一。 设备及试剂 试管凝集抗原 被检血清 0.5%的石碳酸生理盐水 吸管 试管 试管架 孵箱 操作步骤 被检血清的稀释:一般情况下,每份血清用5支小试管,第一管加入2.3毫升石碳酸生理盐水,第二管不加，第三、四、五管各加入0.5毫升.用1毫升吸管吸取被检血清0.2毫升,加入第一管中,混匀。混匀后, 以该吸管吸取第一管中血清加入第二和第三管各0.5毫升，以该吸管将第三管混匀，并吸取0.5毫升加入第四管,依次稀释到第五管,混匀后从第五管吸出0.5毫升弃去.如此稀释后,从第二管起血清稀释度分别为1:12.5 1:25 1:50 1:100 操作步骤 加入抗原:先以0.5%石碳酸生理盐水将抗原原液做适当稀释（一般是作1:10稀释）,稀释后的抗原加入各稀释的血清管（第一管不加，作为血清对照）,每管0.5毫升,混匀。加入抗原后，第二管至第五管每管总量为1毫升，从第二管起血清稀释度分别为1:25 1:50 1:100 1:200，从第一管再吸出0.5毫升，剩1毫升。 对照管的制作: 抗原对照（适当稀释的抗原加石碳酸盐水） 被检血清对照 阴性对照（阴性血清稀释后加抗原） 阳性对照（阳性血清稀释到原有滴度加抗原） 然后将试验管和对照管充分混匀后，放于37℃温箱中20-22小时后取出，在室温下放置2个小时，以比浊管为标准判定结果。 结果的判定 判定比浊管的制备:每次试验须配制比浊管作为判定的标准依据. 配制方法是:取本次试验用的抗原稀释液（一般1:10）5-10毫升，加入等量的0.5%石碳酸生理盐水作倍比稀释，按下表配制比浊管 比浊管的配制 试管凝集反应标准比浊管配制 管号 抗原稀释液（ml） 生理盐水（ml） 透明度 标记 1 0.00 1.00 100% ++++ 2 0.25 0.75 75%