《医学遗传学（哈医大）》基因操作.ppt

分子杂交 点印迹 （dot-blot）法 dot and slot hybridization allele-specific oligonucleotide, ASO ASO杂交 His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala CAT CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC His Leu Thr Pro Val Glu Lys Ser Ala CAT CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT GCC CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT 医 学 遗 传 学 基 因 操 作 本章节重点 重组DNA技术 分子杂交技术 PCR技术及应用 重组DNA技术（recombination DNA technique）指将目的DNA片段或人工合成的基因，通过载体在体外重组、转移并插入到另一种生物的基因组中，使其表达为新的性状或用于进一步的研究，是基因操作的核心技术。包括DNA克隆（DNA cloning）和分子杂交（molecular hybridization）。 重组DNA 构建 转化 扩增（克隆） 分离和检测 重组DNA 重组DNA技术流程简图 ligase vector restriction endonuclease foreign DNA bacterial cell host 限制性内切核酸酶 限制酶：能够识别DNA链的特定部位并能进行切割。 TypeⅠ TypeⅡ TypeⅢ ? EcoRⅠ 属名 种名 菌株名 酶的序号 限制性内切核酸酶 限制酶：能够识别DNA链的特定部位并能进行切割。 HaeⅢ 5’ 3’ 3’ 5’ G G C C C C G G 5’ 3’ 3’ 5’ G G C C C C G G MboⅠ 5’ 3’ 3’ 5’ G A T C C T A G 5’ 3’ 3’ 5’ G A T C C T A G BamHⅠ 5’ 3’ 3’ 5’ G G A T C C C C T A G G 5’ 3’ 3’ 5’ G C C T A G G A T C C G PstⅠ 5’ 3’ 3’ 5’ C T G C A G G A C G T C 5’ 3’ 3’ 5’ C T G C A G G A C G T C 限制性内切核酸酶 进行DNA重组，需要载体DNA和外源DNA具有相同序列的粘性末端。 相同的限制酶 识别相同靶序列的不同限制酶 识别不同序列，但能产生一致粘性末端的限制酶 限制性内切核酸酶 DNA连接酶 一种封闭DNA链上缺口的酶，借助ATP水解提供的能量催化DNA链的5’ -PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键。 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 运载体（Vector） 运载体是能将外源目的DNA导入受体细胞，并可自我复制和增殖的工具。 分子量小。 有多种限制酶切位点。 有可供选择的标记基因或报道基因。 克隆载体有复制起点，表达载体有启动子。 插入型 置换型 克隆载体 表达载体 运载体（Vector） 运载体是能将外源目的DNA导入受体细胞，并可自我复制和增殖的工具。 质粒是存在于许多细菌中，独立于染色体外的双链闭合环状DNA分子。 质粒（plasmid） agtgaattCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcat pUC19 2686 bp Ori ApR LacZ EcoRⅠ SacⅠ