靶向山羊驻FosB 基因的shRNA 重组干扰腺病毒的制备及鉴定.pdfVIP

11 1 农业生物技术学报，  年， 第  卷， 第  期， 第  页  2011  19  2  381~387  JournalofAgriculturalBiotechnology,2011,Vol.19,No.2,381~387  研究资源  Resources  靶向山羊驻FosB 基因的 shRNA重组干扰腺病毒的制备及鉴定 郑惠玲 *  安俊辉 闫林慧 杨振宇 祝珍珍 西北农林科技大学动物科技学院， 陕西省农业分子生物学重点实验室， 杨凌 712100  *通讯作者,zheng.huiling@  摘 要 驻FosB 作为 FosB 的一种截短型， 具有广泛的生物学功能， 在脂、 钙沉积和药物成瘾等方面有重要作 用。本研究采用  干扰技术， 通过制备重组干扰腺病毒对山羊 Caprar hircus 驻FosB 基因进行沉默， 进一 RNA  ( ) 步研究山羊 驻FosB 基因在脂、 钙沉积方面的相关功能及作用机制。实验采用 BLOCK­iTshRNA 腺病毒干扰 系统， 将预先设计好的寡聚 shRNA­492/572 经退火复性后克隆入穿梭质粒 pENTR/CMV­GFP/U6 中。 经干扰 效率检测后， 选择 pENTR/CMV­GFP/U6­572 与病毒骨架质粒 pAD/PL­DEST 进行同源重组， 获得重组干扰 腺病毒载体 pAD/PL­DEST/CMV­GFP/U6­572， 并转染 HEK­293 细胞， 经包装、 扩增后即可产生干扰腺病毒  驻FosB ，  法测定其滴度为  伊   9  。用  驻FosB 感染山羊的乳腺上皮细胞  AD­ ­572 TCID50  1.58 10 PFU/mL AD­ ­572  ，经  及实时定量  检测证明在病毒感染  、  和  后，山羊乳腺上皮细胞中 (MOI=200) Westernblot  PCR  24 48  72h  驻FosB 表达量分别下调了  ，  和  ， 其蛋白表达水平也明显下调， 干扰效果明显， 可用于后续 mRNA 45% 73% 81% 的基因功能研究。 关键词 山羊，驻 FosB ，  干扰， 腺病毒  RNA  PreparationandIdentificationofRecombinantAdenovirusesCarryingShort  HairpinRNATargeting 驻FosB  ofGoat  *  ZhengHuiling  AnJunhui YanLinhui YangZhenyu ZhuZhenzhen  CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,KeyLaboratoryofMolecularBiologyforAgriculturein  ShaanxiProvince,Yangling712100,China  *Correspondingauthor, zheng.huiling@  DOI:10.3969/j.issn.1674­7968.2011.02.027 Abstract 驻FosB ,atruncatedformof FosB,which