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第九章 蛋白质组研究中的翻译后修饰 1. 磷酸化蛋白质组研究 1.1 概况 1.1.1 蛋白质磷酸化 蛋白质可逆磷酸化在调节信号转导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心。是泛指把磷酸基团通过酶促反应转移到其他化合物的过程。则是指由蛋白激酶催化的把ATP或GTP γ位的磷酸基移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白磷酸酶催化的，称为。蛋白激酶 (Protein kinasePK)催化蛋白质的含羟基氨基酸丝／苏和酪的侧链羟基形成磷酸酯。蛋白质磷酸酯酶 (Protein phosphatasePPase) 催化磷酸蛋白的磷酸酯键水解而去磷酸化。细胞内任何一种蛋白质的磷酸化状态是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的两种相反酶活性之间的平衡决定的。1.2 磷酸化蛋白质组研究策略 在蛋白质的磷酸化研究中，样品制备1.3 磷酸化蛋白质的富集策略 1.3.1磷酸化蛋白质的富集 ⑴ 磷酸化蛋白质抗体 1.3.2 磷酸化肽段的富集策略 1) 固定金属螯合亲和层析 IMAC技术最初用于纯化含组氨酸的蛋白质，现在常被用于选择性地富集磷酸化肽段，对磷酸化蛋白质的富集无效。 IMAC柱填料的基本构成是色谱填料-交联剂-金属螯合剂。色谱填料与金属螯合剂亚氨基二乙酸或次氮基三醋酸交联成为固定相，常用的金属离子Fe3+、Ga3+或Cu2+等被螯合到固定相上。磷酸基团与固相化的金属离子通过静电作用吸附，可选择性地亲和提取磷酸化肽段，在碱性环境下或有磷酸盐存在时，这种相互作用被破坏从而使磷酸化肽段被洗脱。据报道Ga3+的富集效果要好于Fe3+，但大多数实验表明，Fe3+的效果是也可接受的，而且由于Fe3+价格便宜和易于操作的优点，因而，Fe3+比Ga3+的应用更广泛些。 2) 磷酸基团亲和取代 将磷酸肽上的磷酸基团用另一种亲和基取代，再用亲和提取的方法从混合物中分离富集磷酸肽，是近几年出现的一种新技术。主要有两种取代方式：一种是使磷酸基团在碱性条件下发生β消除反应生成双键，再用巯基乙醇通过加成反应取代磷酸基团的位置，最后通过交联剂在巯基上连接生物素，并用亲和素色谱柱分离这种方法只适合于磷酸化丝氨酸和苏氨酸的取代；另一种是通过化学反应在磷酸基团上连接一个半胱胺基团(cysteamine)，修饰的磷酸肽用固相化的碘乙酰凝胶亲和提取，这种方法适合各种磷酸氨基酸的取代。这两种磷酸基团的亲和取代方法都需要进行化学反应为了避免副反应的影响，都需要对蛋白质中的一些活性基团进行保护，整个反应体系比较复杂。 1.3.3 磷酸化蛋白质/肽段富集策略的优缺点 1.4 磷酸化肽段的质谱检测 1.4.1以MALDI 为离子源 1.4.2 以ESI为离子源 在三级四极串联质谱仪中，连续扫描第一个分析器Q1，使各种质荷比的离子依次通过Q1，Q2为碰撞室，将Q3分析器设定为只能传输某一特定质荷比的子离子，如m/z79 (PO3-)的离子，这样得到的质谱图仅显示会产生m/z79的谱峰。由于多肽产生的各种碎片离子几乎没有质量数在79 Da附近的，所以用这一质量数进行磷酸肽母离子扫描的特异性很高，但必须在负离子检测模式下分析，进行序列分析较困难。Annan等以这种扫描方式为基础建立了一套分析磷酸肽的系统方法，肽混合物先经LC-MS分析，在负离子检测模式下经母离子扫描找出含有磷酸肽的液相馏份，收集该馏份再次用母离子扫描方式确定磷酸肽，最后在正离子模式下对该磷酸肽进行序列分析。该方法后来又优化为采用毛细管液相色谱和微量馏份收集装置，灵敏度有了很大提高。如果能在正离子模式下进行磷酸肽的母离子扫描则分析步骤会简化很多这需要磷酸肽能够产生合适的特征离子。酪氨酸磷酸肽能产生m/z为216.043的特征离子这是磷酸酪氨酸的亚氨离子选离子进行母离子扫描可以在正离子检测模式下选择性检测酪氨酸磷酸肽。但是由各种氨基酸残基产生的质量数在216.043附近的碎片离子有不少四极杆质量分析器的分辨率较低选择性会差，飞行时间质量分析器不是扫描型分析器所以QTOF型质谱仪不能实现真正意义上的母离子扫描。解决这一问题的主要设计方案是Q2 pulsing就是使子离子在进入TOF分析器之前先被一个脉冲电场俘获(trap)很短的一段时间离子的释放与TOF分析器正交加速电场的脉冲电压同步这样可以使小分子碎片离子的传输率提高到95%以上。在具有Q2 pulsing功能的仪器上如AB Qstar可以成功地进行母离子扫描分析。Steen等对三级四极质谱仪与Qq pulsingTOF质谱仪的母离子扫描功能进行了比较结果表明二者均可在负离子模式下进行m/z79的母离子扫描。而正离子模式下m/z为216.043的母离子扫描只适用于Qq pulsingTOF质谱仪。他们还用m/z216.043母离子扫描方法结合免疫沉淀技术对EGF受体信号通路中的