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纳豆杆菌液体发酵条件优化的研究 Study on the optimization of submerged fermentation of bacillus natto 答辩人：李曙怀 指导老师：李文亮 纳豆菌液体发酵条件研究的意义 纳豆中含有丰富的纳豆激酶,其具有高效的溶栓作用,很好的稳定性,疗效不会受人体的胃肠等特殊环境影响,纳豆激酶在人体内的半衰期较长,无需大量服药,由于其特殊的溶栓机理,病人服用后不会引发体内出血现象。纳豆激酶生产成本较低,安全性好,具有开发为新一代溶栓药物的潜力。目前生产纳豆激酶大部分是通过液体发酵而来，因此本次实验具有重要意义。 主要内容 本实验是从一株实验室分离保存的具有溶血栓活性的纳豆菌出发，在同组同学实验得出的最佳产酶条件的基础上，对发酵温度、ph、装液量、接种量进行优化研究，为工艺化生产建立科学的依据。 细胞干重的分析方法 发酵过程中细胞干重的测定:主要使用比浊法。取0.5m1发酵液，用蒸馏水稀释20倍，γ=660nm处，测定细胞悬浮液的吸光度OD660。细菌离心后，称其干重，作出干重与OD660的关系曲线，结果如下图 细胞干重与菌悬液OD660的关系 温度的优化 本试验共设置了30℃、35℃、40℃、45℃四个温度，观察温度对细菌生长及产酶的影响。 不同温度的生长曲线 不同温度下NK酶的产量 pH的优化 试验检测了Ph6、pH7、pH8、pH9、Ph10五个梯度下细胞的生长和产酶情况。生长是测定48h时OD660，产酶则以第四天的产酶进行比较。 pH对生长的影响 pH对产酶的影响 装液量的优化 本试验在转速一定的情况下，在100ml三角瓶中分别加入10ml、20ml、30ml、40ml培养基，在培养48h后测定其OD660，在培养96h其发酵产酶情况。 不同装液量的生长曲线 不同装液量的产酶量 接种量的优化 本试验在一定量的培养基中（20ml/100ml）分别接入1%、2%、3%、4%的种子培养基，在18h时测定培养基的OD660，而在96h测其NK酶活性。 不同接种量对生长的影响 不同接种量对产酶的影响 结论 细菌在40℃时生长最为迅速，细胞量最大，但对产酶来讲，35℃为最佳温度，而35℃时生长略低于40℃，故选择35℃作为发酵温度:pH7是细菌生长和产酶的最适pH;该菌种是好氧菌，装液量小利于细菌生长和产酶，但装液量过小，水分挥发过快，不利于NK总产量的提高，故选择20m1/100mL:接种量以2%为最佳。 * * 细胞干重与菌悬液OD660的关系 y = 15.739x - 0.2448 R 2 = 0.9837 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 菌悬液OD660 细胞干重（g/L) 综上所述，细菌在40℃时生长最为迅速，且可获得最大细胞量，但是产酶则以35℃为最佳，而35℃时的生长略低于40℃，因此选择35℃作为发酵温度比较合适。 综合以上试验结果得出，当pH偏碱性时利于细胞生长，但不利于产物的合成，而pH值偏酸性，既不利于菌体生长，也不利于产物合成;因此选择pH为7时较为合适。 随着装液量的上升，无论是细胞量还是产酶量都呈下降趋势。从菌种鉴定情况知道，该试验用菌是好氧菌，溶氧的升高有利于细菌的生长和产物合成。10mL虽然利于细菌生长和产酶，但装液量少，培养基中水分挥发快，对总的产酶量不利。因而进一步比较了10ml与20ml装液量时的生长发酵曲线。 由此得出，10ml装液量有利于细菌生长和产酶，但由于培养基量少，水分更易挥发，因此可能会使细菌更早进入衰亡期，所以从比酶活来看，其比酶活反而略低于20ml装液量。同时到发酵结束时，10ml装液量往往剩余不足5ml。故而不利于产酶总量的增加。综合以上种种利弊，仍选择20ml装液量。 结果显示，不同的接种量对生长影响不大，其中以3%略高些，但产酶则以2%接种量为最佳，高接种量反不利于酶的合成。