植物线粒体的制备及其呼吸耗氧的测定.pptVIP

植物线粒体的制备及其呼吸耗氧的测定 I 线粒体的制备 一. 原理 在接近生物材料自身的生理条件下（合适的pH、等渗或高渗浓度等），可采用分级离心方法将线粒体颗粒与其他细胞内含物在亚细胞水平上分开，然后在一定的离心力下收集线粒体。针对植物组织比较脆弱及其细胞含有较大量的有机酸等特点，不宜采取激烈的破碎方式，根据不同种类材料灵活掌握介质的pH。在介质中加入一些高分子化合物可除去酚类的干扰。为了去除其它细胞器的污染，获得纯净的线粒体，本实验采用蔗糖衬垫离心法进行提取。 二. 仪器设备 冰冻离心机、组织捣碎机 三. 材料及试剂 1. 材料：挑选籽粒饱满的绿豆种子20g，用沸水烫 后，均匀铺在带有湿润滤纸的培养皿中，37℃下黑暗 萌发3-4d。去掉种皮和胚根，用滤纸吸干表面水分， 备用。 2. 试剂 ① 提取及洗涤介质：50mmol/LTris-HCl 缓冲液内含 0.3mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、 0.2mmol/L二硫苏糖醇和1mg/mL，pH 8.0； ②悬浮介质：除不加牛血清蛋白外，其余与提取介质 相同。 四. 实验步骤 线粒体的提取：称取10g去除种皮及胚根的绿豆幼苗放在4℃ 冰箱中饥饿1小时，然后迅速在冰浴中研磨，开始加入少量 提取介质，最后加至材料体积的一倍。 2. 匀浆用4层纱布过虑，滤液在4℃、1000g离心 10min。 3. 取上清液，4℃、11000g离心20min。 4. 弃上清液，向沉淀中加入提取介质5mL，悬浮， 4℃、11000g离心15min。 5. 弃上清液，收集沉淀，并悬浮于1ml悬浮介质中。 6. 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝法），根据所测定蛋 白质含量，用悬浮介质将线粒体悬浮液稀释成1mg蛋白 质/ml线粒体悬浮液，4℃保存备用。 II 线粒体耗氧测定一、原理 氧电极又称Clark电极，由嵌在绝缘棒上的铂 和银构成，以氯化钾溶液为电解质，覆盖一层15- 20?m厚的聚乙烯或聚四氟乙烯薄膜，两极之间为极 化电压。溶氧可透过薄膜进入电极，在铂阴极上还 原，同时在极间产生扩散电流，此电流与溶解氧浓 度成正比。由于氧电极可以直接测量溶液中溶解氧 的浓度，并且对溶液中氧的吸收或释放所引起的浓 度变化十分敏感，所以可以用作测定线粒体的呼吸 强度。 二、仪器设备 OXYGRAPH 氧电极 三. 材料和试剂 1. 材料：纯化线粒体制剂 2. 试剂 ① 饱和亚硫酸钠溶液 ② 反应介质：含0.4mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗 糖、10mmol/LKCl、10mmol/LMgCl2、50 mmol /L磷 酸缓冲液（pH7.4）、10mmol/L Tris (用HCl 调至 pH7.4)。 四. 实验步骤 1. 电极膜安装： 使用清洁的电极可以获得最好的测定结 果，因此，在使用电极之前要先清洁电极。 ① 在圆形电极的顶部加一小滴半饱和氯化钾电解液。② 取一块长约为3.5cm、宽约为0.5cm的长形盐桥纸片覆盖在电解液上，并且至少使其一角在电极的凹槽内担当盐桥的作用，然后取一块电极膜覆盖在盐桥纸片上面。 ③ 将电极的“O”型圈放在装膜器的末端，然后将装膜器垂直于圆形电极的顶部，向下滑动装膜器的外套，推动“O”型圈套在覆有电极膜的电极上。④ 检查电极膜是否平滑，膜内不能存有气泡，然后在电极凹槽内加入几滴电解液。  ① 将电极室下部的底座逆时针旋转取下，将外部“O”型圈安置 在电极外部的凹槽圈内，垂直握住电极室，将电极放入电极 室，使覆有薄膜的阴极(铂极)成为反应杯的底部。 ② 将安装好的电极室安置在控制盒上方的黑色磁力搅拌器上。③ 通过S1/ADL连接线将电极与控制盒连接(一端插在控制盒的INPUT插口，另一端插在电极的SMB控制器上)，为电极提供极化电压。④在反应杯中加入少量的水（0.2-2.5ml），然后放入小磁力棒。 3. 电极控制盒与计算机的连接 通过RS232数据传输线将氧电极控制盒与计算机连接起来，数据传输线的一端接入控制盒背后的RS232 INPUT接口，另一端接到计算机的COM1或COM2端口，电源线连接到控制盒背后的12V插孔上。 4．电极校正 ① 在反应杯中加入0.2-2.5ml的被空气饱和的去离子水(蒸馏水)，放入磁转 子，并且设置适当的转速启动转子。 ② 在工具栏上点击“Calibrate”按钮开始校正，软件将提示“Establish an air line in the chamber”(建立空气线)，点击提示框上的“确定”后，氧电 极便会在屏幕记录一条被空气饱和蒸馏水中的氧含量信号线。 ③ 当信号线走平后，按“Stop”按钮，软件将提示“Establish zero oxygen in th