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水溶液中酶含量的分析测定 曾平 为什么要测定酶的含量？ 酶的应用十分广泛：作为分析试剂（检测血糖或尿糖浓度，ELISA体系中作为指示剂）；多种有机化合物的实验室和商业合成(如从葡萄糖产生果糖)，生物大分子的降解（如淀粉生成葡萄糖，基因图谱中DNA的特异剪切，低相对分子质量化合物的降解），特定生物大分子的合成（如PCR反应中合成DNA）等。因此，很有必要对酶的含量进行测定。 酶含量的主要测定方法 双缩脲法双缩脲法 Folin-酚试剂法 Folin-酚试剂法 紫外吸收的直接测量法 紫外吸收的直接测量法 结束语 该方法基于碱性溶液中Cu2 +与蛋白质中两个邻近肽键的专一性反应。因此，不同蛋白质之间氨基酸组成的差异不会显著影响测定结果。 1. 配制适当浓度范围的蛋白质标准液（通常为 1~20mg/mL之间）。 2. 取1mL各标准蛋白质溶液分别加在不同的试管中。[用1mL蒸馏水或合适的溶液作空白对照。] 3.取1mL各待测溶液分别加到不同的试管中。 4. 取1mL双缩脲试剂（1.5gCuSO4·5H2O，6.0g酒石酸钾钠溶解于300mL 100 mg·mL-1的NaOH中）分别加到所有的标准液、待测液及空白试剂中。 5. 试管在37℃保温15min。 6. 520nm波长处用空白试剂调零，测出各种溶液的吸光值。[溶液的颜色可保持几小时不变。] 双缩脲法的主要缺陷是灵敏度低，因而不适用于蛋白质浓度小于1mg/mL的溶液测定。酶含量的主要测定方法 实验实验材料、主要仪器： ①、Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。②、实验材料、主要仪器：绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）、722型（或721型）分光光度计、4 000r/min的离心机、分析天平、容量瓶（50mL）、量筒、移液管（0.5mL、1mL、5mL）。 ③、试剂(纯度均为分析纯) (1)0. 5mol/L NaOH (2) 试剂甲： (A)称取10g Na2CO3，2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。 (B)称取0.5g CuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。 每次使用前将(A)液50份与(B)液1份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。 （3）试剂乙： 在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)和700mL蒸馏水，再加50mL 85 ％磷酸和100mL浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色(倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min)。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L。 实验操作： 1．标准曲线的制作 （1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250μg/mL的牛血清白蛋白溶液。 （2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6支普通试管，按表1加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。30min后，以不含蛋白质的1号试管为对照，用722型分光光度计于650nm波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。 标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。 样品的提取及测定 （1）准确称取绿豆芽下胚轴1g，放入研钵中，加蒸馏水2mL，研磨匀浆。将匀浆转入离心管，并用 6mL蒸馏水分次将研钵中的残渣