关于细菌质粒的实验.doc

一 细菌 细菌是我们用来扩增质粒的宿主。原因有两个方面：1 细菌的增殖速率极快，可以快速的放大我们的质粒拷贝数；2 细菌体内有严格的DNA合成保真能力，能够确保质粒被忠实的复制。但是，细菌体内有严格的限制-修饰系统，对有些质粒会有修饰甚至切割的作用。所以对于有些特殊的质粒，一般会说明哪种细菌适合作它们的宿主。 目前我们用的最多是DH5α ，JM109。我们实验室目前有的是DH5α。我们用到的Pcdna3,T载体 都是可以用DH5α 作为宿主。 DH5α 是以LB培基作为培养液。LB培基可以在分子克隆上查到配方。以后你要是用到其他的细菌时，可能会有不同的培养液。 二 培养基 细菌培养基，目前我们用的最多的是两种形式，一种是液体培基，一种是固体培基。两种培基的用途不同。所谓的固体培基是在液体培基中加入琼脂（英文agar）（切记不是琼脂糖agarose）,每一升液体培基里加入15g琼脂。之后高压灭菌，琼脂与液体培基熔为一体，之后铺板。具体操作可以在以后做的时候再说。两种形式的培基用途在后面会说道。 三 质粒 我只用过质粒，病毒我没有用过，就不说了。这方面的资料很多，你可以有空看看。我们用的质粒主要是两大类：1 测序用的质粒，如 最常用的T载体；2 表达载体。表达载体又可分为两类，一是蛋白表达载体，一是RNA表达载体。蛋白表达载体是用来在细胞内表达目的蛋白用的，RNA表达载体不是太清楚，但是用作RNAi的载体是属于RNA表达载体的。我们这边的蛋白表达载体是p CDNA 3 .质粒根据在细菌体内的拷贝数分类可以分为严谨型和松弛型。这两者的区别你可以不必太在意，如果你想知道可以在书上查到。对于我们运用过程中，主要涉及到我们用的抗生素的浓度不同罢了。这里还涉及到质粒不相容性的原理，我在这里稍微提一下，以后如果你要做共转染的时候可能要考虑到。我们知道，质粒是分派系的，就是说往往一类质粒有一个共同的模板，然后在这个模板的基础上进行修饰，从而得到的一个系列。一个质粒在细菌内的复制不仅受到细菌体内DNA聚合酶系统的作用，而且还受到其自身编码的一种负性调节蛋白的作用。就是说这种蛋白达到一定的量的时候，会抑制住质粒自身的复制。当细菌体内只有这一种质粒的的时候，这种负性调节蛋白的量不足以抑制住质粒的复制，但是一旦你转化了两个同一类的质粒，它们会表达相同类型的负性调节蛋白，这样负性调节蛋白的量就会上升，会同时抑制住两种质粒的复制，这样你的转化就会失败。 我在这里主要讲一下T载体和Pcdna3 这两种质粒。 T 载体我们最常用于测序用的。目前比较好的，价格适中的是宝生物公司的PMD18-T 载体，效果很好。这种载体有一些特殊性。它本身是经过酶切的，所以是线性的。它的两个末段有一个T。因为我们知道，我们所用的大多数的Taq酶在扩增PCR产物的时候，会在末断加一个A，所以该载体正是利用了Taq酶的这种属性，可以将PCR产物连接到载体上。一旦连接之后，就成为了环形。具体的操作，你以后用的时候可以去看一下这个载体试剂盒的说明书。他们设计的很好，所有的东西配成一个盒子，很方便。T 载体是氨卞抗性的，就是氨卞青霉素。用它来作为筛选压力。浓度一般为60ug/ml. p CDNA3 是一种表达载体，它可以在原核和真核系统之间穿梭。它有这么几个简单的结构元件：1 复制起始子，这个复制起始子是属于原核系统的，这样保证它能够利用原核的核酸复制系统进行复制；2 SP6 启动子，这同样也是一个原核系统的，它位于抗性基因的调空区，用于启动抗性基因的转录，它以及抗性基因的存在赋予了宿主菌的抗生素抗性属性；3 抗性基因，这里是一种分解代谢氨卞青霉素的酶；4 T7 启动子，这是一个真核启动子，它是当质粒进入细胞之后，利用细胞内的RNA 聚合酶进行转录的调空元件。它直接控制着目的基因的表达，5 NEOR 这也是一个抗性基因，是新霉素抗性基因。它是当你要进行稳定转染，就是说你要建立一个稳定表达株时，需要用到的。它同样也是受到真核启动子的调空；6 MCS，这是多克隆位点，就是一段序列，里面集中分布了很多限制性酶切位点，主要用于你将目的基因插入其中。好了，先讲这么多，如果你以后还想知道的更多，再去查书吧！ 四 细菌的复苏 我们的细菌，不论是没有转化质粒还是已经转化了质粒的菌，长期保存都是放在-80度冰箱，菌液内加入了终浓度为15%的甘油。细菌由于在-80度冰箱里冻存，都是处于休眠状态，在这种情况下，我们需要将细菌复苏。通常用的方法是配固体培养基，铺成培养板。将冻存的细菌从-80度冰箱中取出，放在冰上融解。用酒精灯对接种环进行消毒，冷却，之后用接种环蘸取菌液在培养板上做之字形划线，37度，孵箱，倒置（盖子在下）培养，过夜，第二天，挑单克隆进行摇菌培