14-3-3蛋白在血小板GPIBa内新结合位点的发现及功能探讨.docVIP

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2017-09-09 发布于重庆
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14-3-3蛋白在血小板GPIBa内新结合位点的发现及功能探讨.doc

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GPIb(膜内段14-3-3新结合点的发现及其对血小板功能的调控作用张卫林1*，元艳宏1*，赵丽丽1，阮长耿2，戴克胜1? 作者单位：1北京航空航天大学生物与医学工程学院血液与细胞生物学实验室；2苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所，卫生部血栓与止血重点实验室?通讯作者：戴克胜，，E-mail: kdai@buaa.edu.cn.GP）Ib( 膜内段新的14-3-3蛋白结合位点的存在，探讨该位点对血小板生理功能的调控作用。方法合成氨基酸寡肽，免疫大白兔，得到多克隆抗体。构建GPIb(突变体表达质粒，建立突变型细胞株（1b9、S609A、S559A、S166A、△565和△552）；免疫共沉淀检测GPIb(与14-3-3蛋白的结合情况。流式细胞术检测细胞株在瑞斯托霉素（Ristocetin）诱导下的vWF结合能力，Flow chamber检测细胞株在vWF表面的粘附状况；共聚焦显微镜检测蛋白分布。合成可穿膜寡肽，检测各寡肽对血小板聚集功能的影响。结果 14-3-3蛋白与559位点磷酸化寡肽有结合，而与非磷酸化寡肽无结合。纯化的GPIb(可分别与两种抗体反应，而应用磷酸酯酶对其脱磷酸处理后，只与非磷酸化抗体反应。△565细胞株中14-3-3蛋白与GPIb(有结合，而与△552细胞中GPIb(无结合。S559A 细胞的Ristocetin诱导vWF结合能力显著减低，在vWF表面的粘附明显减少；可穿膜磷酸化寡肽对Ristocetin诱导的血小板聚集功能有抑制作用，且呈剂量依赖；而对ADP和thrombin诱导的血小板聚集无影响。磷酸化寡肽可直接抑制血小板与vWF结合；流动状态下，寡肽处理的血小板在vWF表面的粘附数量明显减低。结论血小板GPIb(膜内段存在一个新的14-3-3结合位点， 559位丝氨酸在血小板中存在磷酸化和非磷酸化两种状态，其磷酸化状态对血小板功能有调节作用。