精浆游离mRNA一般特征及附睾液游离mRNA功能的初步研究.doc

中 文 摘 要 第一部分 人 cfsRNA 的提取及含量、种类、来源分析 目的：建立提取 cfsRNA 的有效方法，了解其含量、种类、来源。为进一步 探索 cfsRNA 的临床应用价值及存在意义奠定基础。 方法：收集精液参数正常的男性精液标本，联合应用 Trizol LS Reagent 和 RNeasy Kit 提取和纯化 cfsRNA，RT-qPCR 扩增管家基因 β-actin (ACTB)比较纯化 前后 RNA 提取效果，建立稳定的提取纯化技术，RT-qPCR 扩增 ACTB 分析精液 参数正常男性 cfsRNA 含量，并通过琼脂糖凝胶电泳和 Agilent 2100 Bioanalyze （Lab on chip）的双重检测，验证 cfsRNA质量及种类。用 Affymetrix 公司的 Human Gene 1.0 ST Array，分析精液参数正常的男性 cfsRNA 的 mRNA 种类及来源。 结果：联合应用 Trizol LS Reagent 和 RNeasy Kit 提取和纯化的 cfsRNA，用 于荧光定量 RT-PCR 所得到的 ct 值比不纯化所提取 cfsRNA 明显提前，差异有显 著性意义（P0.01）。对 10 例精液参数正常标本分析，cfsRNA 含量范围为每毫 升精浆 0.87 μg 到 3.64 μg，RNA 分子完整性指数 RIN（RNA Integrity Number） 为 6.4。28S 与 18S 倒置，比值为 0.6。Agilent 2100 Bioanalyze 的结果分析说明 cfsRNA 可能种类繁多，包括 28S rRNA, 18S rRNA 和小分子 RNA（如 5S rRNA, tRNA，microRNA 等）及在这一范围间大量存在的大小不等的 mRNA 分子。 cfsRNA 芯片分析结果共 20106 种转录子存在，已知基因 14,575 个，其中 12,089 为已知基因，并有基因表达信息，其余为假基因、未知功能转录、小 RNA 等。 芯片结果表达信息提示 cfsRNA 来源于多个男性生殖器官，其中前列腺表达而睾 丸不表达 2,009 个，睾丸表达而前列腺部表达 1,529 个，前列腺和睾丸均表达 2,518 个，其余 6,033 个不在睾丸和前列腺中表达。 结论：联合应用 Trizol LS Reagent 和 RNeasy Kit 可获得大量 cfsRNA，能应 用于 microarray、northern-blot、RT-PCR 等技术。cfs-mRNA 种类繁多，来源于 多个男性生殖器官。可能成为精浆来源器官某些疾病（如肿瘤、基因表达异常所 致疾病等）的无创性诊断、性犯罪法医鉴定等方面的新分子标志物。 关键词：精浆；游离 RNA；男性生殖系统； iv 第二部分 人 cfs-m RNA 一般特性分析 实验一 人 cfs-m RNA 完整性及稳定性分析 目的：考虑到上述应用前景和优势，研究 cfs-mRNA 的一般特性是否满足分 子检测技术的基本要求。本部分主要是研究精液正常男性 cfs-mRNA 的完整性、 稳定性、是否与其他物质结合存在。本部分的完成将为进一步研究病理情况下 cfs-mRNA 及其应用研究奠定严谨的实验基础。 方法：本部分采用分析mRNA的完整性的公认的方法，即针对mRNA不同部 位：分别设计可扩增全长及针对 5′端、3′端及中段片段的引物，收集精液参数正 常的精浆标本 9 例，通过RT-qPCR的方法定量比较ACTB、DDX4 mRNA 各自 5′ 端、3′端及中段片段的量的差异，以转录子 5′端为 1，分析其 3′端及中段相对 5′ 端的比例，从而反映mRNA的完整性。在室温下静置，分别于 0 min、20 min、 45 min、90 min及 24 h取出 400 μl精浆，提取cfsRNA，荧光定量RT-PCR检测人 ACTB、DDX4 mRNA不同片段的量变及大鼠ACTB mRNA的量变规律。 为分析cfsRNA是否以与大分子结合形式存在而逃避精浆RNA酶的降解作 用，精液参数正常男性精浆标本分别通过直径分别是 5.0 μm、0.45 μm、0.22 μm 的滤膜分别过滤，运用荧光定量RT-PCR观察过滤前后ACTB、DDX4 mRNA的量 变规律。由于Triton X-100 可以分解大分子结合物质，我们收集 5 人精浆，分为 两等份，一份加TritonX-100 (终浓度为 10 ml/L)以分解蛋白质、脂类等物质，室 温下静置 20 min，另一份在提取RNA时加入TRIzol LS后加入，分别于 0、5、10、 20 min时取 400 μl精浆，荧光定量RT-PCR分析精浆ACTB、DDX4 mRNA的量变 规律