在酵母中异源表达人破骨细胞钠氢转运蛋白.pdfVIP

中国骨质疏松杂志 2012年 1月第 l8卷第 1期 ChinJOsteoporos，January2012，Vol18，No．1 PublishedonlineWWW．wanfangdate．com．cn doi：10．3969／j．issn．1006-7108．2012．O1．007 · 论 著 · 在酵母 中异源表达人破骨细胞钠氢转运蛋 白 黄晓斌 仲蕾蕾 中图分类号 ：R681 文献标识码 ：A 文章编号 ：1006—7108(2012)0卜0024—05 摘要 ：目的 在酿酒酵母中异源表达人破骨细胞分化成熟潜在 因子钠氢转运蛋 白2(HsNHA2)，鉴定 其作为盐离子载体转运Na 的功能 ，并对其在细胞中的表达进行初步定位分析。方法 采用高保真 PCR试剂盒扩增出HsNHA2；构建酵母表达载体，通过 电穿孔的方式转入到酿酒酵母菌株中；Western 印迹检测其在酵母菌株 的表达 ；通过 NaC1选择压力观察菌株在高盐环境 中的生长表型，并用根皮素 抑制 HsNHA2观察其抗盐功能；最后用细胞原位荧光染色确定 HsNHA2在细胞中的表达位置。结果 Western印迹证实 HsNHA2在酵母菌株 中正常表达 ；生长 曲线显示 HsNHA2可使菌株在高盐环境 中生 长 ，根皮素抑制 HsNHA2表达后菌株不能在 0．2mol／LNaCI培养基 中生长 ；免疫荧光染色初步证 明 HsNHA2表达在细胞膜上。结论 HsNHA2作为盐离子载体在酵母细胞中主要表达在细胞膜上行使转 运 Na 的功能 ，以维持细胞正常生长 。 关键词 ：破骨细胞 ；钠氢转运蛋 白2；酿酒酵母 ；生长曲线 Heterogene0usexpressionofosteoelastHsNHA2inyeast HUANGXiaobin，ZHONGLeilei．Instituteof AgricultureandLifeScience，ChongqingUniversity，Chongqing400030，China Correspondingauthor：HUANG Xiaobin，Email：bmwzzhsh@ gmail，COB Abstract：Objective Toheterogene0uslyexpressHsNHA2，thepotentialfactorforthedifferentiationand maturationofhumanosteoclast，inSaccharomycescerevisiae，toidentifyitsfunctiontotransportNa+ asa salttransporter，andtoconductan initiallocationanalysisofitsexpression incel1．M ethods HsNHA2was amplifiedusingthehighfidelityPCR kit．ThevectorexpressedinSaccharomycescerevisiaewasestablished andtransferred intoBW 31ausing electroporationmethod．Theexpression in the strainwasmeasuredusing Westernblotting．Thegrowth curveofthe strain inhigh salty concentrationmedium wasobserved through NaC1-dependentpressure． The salt—resistantfunction wasobserved using phloretin as an inhibitor for HsNHA2．The location ofHsNHA2 expressed in thecellwasdefined usingfluorescentin situ staining． Results TheresultsofWestern blottingdemonstrated thatHsNHA2 expressed in BW31anormally．The growthcurveshowedthatBW31