8自身免疫性疾病的实验室检测.ppt

五、结果及讨论 1.结果报告 2.结果分析：写出你的诊断，并说明理由。 六、思考题： 如不用ANA间接免疫荧光检测做初筛试验，而用酶免疫分析法、免疫电泳等其他的方法来检测自身抗体，可以吗？ ANA荧光抗体技术 实验步骤： 1. 肝印片制备：取4~8周龄小鼠，断颈处死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用NS洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上形成薄层肝细胞。冷风吹干，丙酮固定20min。 2. 用红蜡笔在玻片上画两个直径1cm的圆圈。 3. 将待测血清和对照血清用PBS作1:10稀释，取50ul加于抗原片记号圈内，放湿盒，37℃温育30min。 4. 取出抗原片，用ddH2O冲去未结合的血清，置PBS（1、2、3平皿）中浸洗，每缸5min，吹干。 5. 滴加稀释的FITC-抗人IgG抗体10ul（勿涂开），置湿盒内，37℃孵育30min。 6. 同步骤4浸洗，吹干。 7. 滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜检查。 第二部分 化学发光、组织配型、流式细胞仪 一、目的要求 1.掌握化学发光、流式细胞仪的测定原理。 2.熟悉化学发光、流式细胞仪临床检测的意义。 3.掌握组织配型的原理、方法及应用。 二、 化学发光、流式细胞仪、组织配型（录像示教） 1.化学发光 2.荧光抗体技术 3.MLR 4.HLA分型技术 5.FCS技术 思考题 在发光免疫分析中，最常见的的三大类型是什么？ 检测HLA抗原的方法常见的有哪两类？ 补体依赖的细胞毒（CDC）试验原理是什么？ 前向散射光（FS）、侧向散射光（SS）分别反映细胞的什么性状？ * Complement mediated lysis 方法： 1） 直接法： 2）间接法 3） 补体法 4）双标记法 用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本进行荧光染色。 应用 细菌学方面：菌种鉴定和Ag结构的研究 病毒学方面：病毒鉴定和病毒在感染cell内的定位 免疫学方面： 1）研究 2）用于自身免疫病的诊断 3）T、B细胞亚群的分离及检测 寄生虫学方面：用于寄生虫的诊断 其它：激素或酶的组织定位 荧光显微镜 抗双链DNA抗体 抗dsDNA抗体与细胞核DNA（外围区）脱氧核糖磷酸框架结合。 抗dsDNA抗体是SLE患者的特征性标志抗体。其抗体滴度与疾病的活动程度有相关性。 12. 抗双链DNA抗体检测 方法：斑点金免疫渗滤试验 在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的（一般在5分钟左右完成）。 阳性反应在膜上呈现红色斑点。 试剂盒组成 ①渗滤装置，是斑点金免疫渗滤试验试剂盒中主要组成成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成；②胶体金标记物 ；③洗涤液 。 操作要点 ①将渗滤装置（或称反应板）平放于实验台面上，于小孔内滴加待测标本1~2滴，待完全渗入；②于小孔内滴加免疫金试剂1~2滴，待完全渗入；③于小孔内滴加洗涤液2~3滴，待完全渗入；④在膜中央显示清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性程度。 抗ENA抗体谱:可提取核抗原抗体的总称 临床常检测的抗ENA抗体谱主要包括： 抗Sm 抗U1-RNP 抗SSA 抗SSB 抗Jo-1 抗Scl-70 抗rib-P蛋白 13. 抗ENA抗体谱的检测与应用 免疫印迹法 SDS电泳 转移电泳 酶免疫检测 免疫印迹法 （1）抗Sm抗体： 是SLE的特异性抗体。 Sm抗原是U族小分子细胞核核糖核蛋白（UsnRNP），具有抗原性的蛋白的分子量是29KD、28KD、13.5KD。 对早期、不典型的SLE或经治疗缓解后的回顾性诊断有一定意义。 Sm抗体和SnRNP是同一分子复合物中的不同抗原位点，抗Sm抗体阳性均伴有抗U1RNP抗体，而抗U1RNP抗体可以单独存在。 （2）抗SSA／Ro抗体： SSA／Ro是小分子细胞浆核糖核蛋白（scRNPs），是蛋白和小分子核糖核酸形成的复合物。抗原是含有Y－YRNA的蛋白质，它更多的存在于胞浆中，其分子量有52KD及60KD。52KD的多肽条带与干燥综合征（SS）相关，而60KD的多肽条带则更多