高内涵筛选—药物开发中的新契机.pdfVIP

高内涵筛选—药物开发中的新契机 展 进 述 综 药物靶点是能够与特定药物特异性结合并产生治疗疾病作用或调节生理功能作用的生物大分子或生物分子结构。在当 代药物开发过程中，发现和选择合适的药物靶点是药物开发的第一步，也是药物开发成败的关键因素之一。当前用于 临床治疗的药物靶点停滞在500多个，用于治疗不到100种的疾病，远不能满足新药研发和疾病治疗的需求【1】。其 次，新药开发受到复杂药物调节机制的制约，临床上药物疗效还涉及到药物代谢以及药物的毒副作用，导致药物在临 床试验中的失败率仍然很高【2】。因此，新药开发迫切需要寻求更多新思路、新方法和新技术的介入来确定优良的 药靶和候选药物。就药物创新而言，转化医学的兴起打破了基础医学与药物开发和临床医学之间的屏障，缩短实验室 到临床的过程，最终能够使患者更快地受益于生命科学的研究成果【3】。 随着当代基因组学的发展． 医学研究模式发生了变化：从经典的序列测定到高通量测序及基因功能分析，从基因组 学到蛋白质组学、代谢组学，从组学到系统生物学研究。在这样的转变过程中，基因组研究使我们能够从基因组的表 型认识人体生理、病理过程中疾病发生、发展规律的本质，有可能从系统整体的角度解决医学问题。基于基因组的转 化医学是推动医学发展和药物开发一个引擎【4】。RNA干扰（RNAi）技术是引入外源性双链RNA分子（siRNA ），在 mRNA水平上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默，从而获得去基因功能表型【5】。这种技术仅需要少量的核 酸序列信号，而且不被蛋白结构所影响。随着2001年人类和其他物种基因组序列初稿完成，现在可以设计合成出针 对每个基因的siRNA ，质粒或病毒载体表达的小发卡 RNA (shRNA) 达到干扰目的基因，从而实现对疾病表型的基因的 筛选。在疾病研究中，如发现某一基因为持续某种表型所必须，其编码蛋白将可能成为疾病治疗极好的靶点。与基 因敲除（gene knock down ）、转基因和其他传统方法相比较，RNAi的技术简单易行、通量高、资金消耗少、周期短， 使得研究人员能够在短时间内大规模地在细胞水平和动物水平筛选药物靶点和评定药靶【6.7】。 RNAi 文库 (RNAi library) 是通过人工构建的siRNA或shRNA有针对性抑制不同基因表达的文库。以RNAi文库为平台 的“loss-of-function screens”可以同时对全基因组的基因进行功能研究和筛选，从而进行高通量大规模药靶探寻，在短 短几年内迅速发展，已取得了引人瞩目的进展【8-14】。Morgan-Lappe 等【10】针对蛋白激酶、G 蛋白偶联受体、 泛素连接酶3、核蛋白等大约3700 个基因构建了siRNA 文库，以肺癌细胞系H1299 为实验对象进行高通量筛选，寻找 和肿瘤生长密切相关的蛋白。首次发现抑制蛋白Ran和TPX2表达后均能使细胞周期阻滞，甚至出现调亡迹象。并进一 步在乳腺癌及Ras 基因突变的癌细胞系中验证了Ran 和TPX2 有望成为治疗肿瘤的新靶点。Cole 【12】等分别在4种成 神经细胞瘤细胞中以loss-of-function genetic screens 的方法筛选与细胞增殖相关的激酶，成功地从592种激酶中筛选 出CHK1作为成神经细胞瘤的治疗靶点。Alexander Karlas等【13】在人宿主细胞中，通过全基因组RNAi筛选，发现了 287个宿主基因影响了A型流感病毒的复制。并在进一步的研究中，发现SON DNA结合蛋白和CDC类激酶1在流感病毒 . de Pril 等【14】在前列腺癌细胞中用腺 的复制中发挥了重要作用，为下一步流感药物的开发提供可能的新靶点。Dr 病毒shRNA文库研究7000多个基因，在96孔板中采用划痕试验并借助IN Cell Analyzer 高内涵细胞成像分析系统筛选出 与癌细胞迁移相关的CXCR4 ， PIK3CA, ROCK2 和PGF四个基因作为可能新药物靶点。 继检测基因水平的基因芯片，转录水平的RNA芯片和表达水平的蛋白芯片等检测手段之后，以RNAi技术为基础的 功能性检测成为了下一代高通量技术的发展方向。RNAi细胞水平高通量筛选与芯片类技术相比，在保持细胞结构和功 能完整性的前提下直接研究基因和细胞功能之间的关系，如生长，分化，迁移，凋亡，以及细胞形态等，更有助于认 识基因和疾病发生发展的关联，从而展开药物靶点的寻找。在过去近十年中，