miRNA_在基因表达调控中作用.pptVIP

* Micro RNA在基因表达调控中的作用 一.怎样定义miRNA(成熟) 1, 长度为22nt的转录体.可通过northern blot等方法检测得到. 2,其前体为典型的发卡结构.miRNA位于发卡结构的茎部分. . 3, 通过Dicer酶的处理后生成. 4,序列具有高度的保守性. 二.miRNA的生成过程 注意事项: 1,通过RNA聚合酶II转录生成.具有mRNA的结构特征 2,可以是多顺反子结构.即一条pri-miRNA包含多个成熟 miRNA的信息. 3,在判断一非编码蛋白质的mRNA是否生成miRNA时,我们可以通过抑制Drosha的活性,观察pri-miRNA的含量是否增加. 4,miRNA可来源于外显子,也可来源于内含子和非编码序列. 5.miRNA在基因组DNA上成族分布,处于同一族的miRNA常共表达 三. miRNA??的作用机制及功能 作用机制:与靶基因mRNA 3-非翻译区通过不完全配对结合降低mRNA稳定性或抑制靶基因的 翻译.此外, miRNA也可与5-非翻译区和编码区序列结合调节靶基因的表达. 有文献报道,miRNA可与mRNA3-非翻译区的其他部位结合,升高mRNA的稳定性. 注意事项: 1, 由于miRNA与靶序列是通过不完全配对结合,因此证实miRNA的靶基因成为一难点. 2,一种miRNA常有多个靶基因. 功能: miRNA??主要通过抑制它的靶基因来起调控作用。miRNA??的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的过程。??Lewis??等人的预测结果发现，预测的??miRNA??的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生的基因。虽然??miRNA??的作用也是特异的，特别是5端的2～8个碱基，特异性的靶向与它的靶基因，但是与??siRNA??不同的是??miRNA??的特异性并不是那么强，在生物体内往往一个??miRNA??作用于多个靶基因 6. 对于同一家族miRNA,其功能常具有互补作用. 比如: 在MYC诱导的B细胞淋巴瘤小鼠模型中,剔除miR-17-92族DNA序列可诱导凋亡,如果导入此族中的任意一种miRNA均可减轻细胞凋亡. 7. 不同miRNA可同时调节同一靶mRNA 1.miRNA与细胞增殖 apoptosis 转录因子p53 miR-34a Stress(H2O2,UV等) Proinflammatory cytokine 转录因子NF-kB miR-146 (1) IL-1 receptor- associated kinase 1 (2) TNF receptor- associated factor 6 抑制cytokine signaling 2.miRNA与细胞凋亡 3.miRNA与细胞信号传导 四.microRNA表达的特点 1,时间特异性 在高等生物,microRNA的表达在生长发育的不同阶段是不同的.. 2,组织特异性 在不同的组织中, microRNA的表达不同的 四.寻找??miRNA??基因 ? 1. Forward genetics 2. MiRNA cloning 3.Computational approaches to miRNA discovery 五.检测??miRNA??表达的方法 1, Northern??杂交 2, ?Real-time RT-PCR 3. 基因芯片的方法 六．怎样预测miRNA的靶基因 第一种方法: 过表达或抑制miRNA的表达,利用基因芯片筛选出差异表达基因.从这些差异表达的基因中,证实miRNA的靶基因. 注意事项: 1.并非所有的差异表达基因都是miRNA的靶基因.许多差异基因表达的改变是由靶基因表达的改变而引起. miRNA 转录因子p53 P53的靶基因 P53的靶基因不是该miRNA的靶基因 2.该方法不能证实miRNA所有的靶基因.根据miRNA与靶基因mRNA 3’UTR的配对程度不同, miRNA可降解靶基因mRNA(配对程度高),也可不降解靶基因mRNA (配对程度低) 但抑制mRNA的翻译, 第二种方法: 由生物信息学预测miRNA的靶基因.预测miRNA靶基因的网站: /mammalian/index.html. / /microrna/home.do / 注意事项: 根据背景知识, 选择两个或两个以上网站均有预测的靶基因做进一步分析 七．怎样证实miRNA的靶基因 5’UTR 3’UTR ORF AAAAAAAAA 靶基因mRNA PCR扩增3’UTR 克隆3’UTR到报告基因lucife