pcDNA3%2fVP1-hIL-2双表达重组质粒的构建及免疫效果观察.pdf

中文摘要 pcDNA3／VPl．hIL．2双表达重组质粒的构建及免疫 效果观察 摘 要 目的：l柯萨奇病毒B组3型(CVB3)是引起人类病 毒性心肌炎韵主要病原体之一。目前尚无有效的防治方法 可以保护人类免受这一病毒的危害。DNA疫苗的出现为建 立有效的免疫预防措施提供了新的思路。根据国内外文献 报道，我室选择了能够刺激机体产生保护性抗体的CVB3 VPl蛋白作为侯选抗原，构建了pcDNA3一VPl真核表达重 组质粒，并进行了免疫效果的观察。结果发现，尽管该DNA 疫苗能诱导小鼠产生中和抗体，但仍存在抗体效价低，不 能有效保护致死量病毒感染的问题。因此如何增强 pcDNA3．VPl的免疫原性，提高其免疫保护率就成为蛹待 解决的关键问题。近几年来的许多研究表明，联合应用细 胞因子可通过不同的环节调节和增强DNA免疫效应，发 挥佐剂作用。IL一2是目前应用较广泛的一种细胞因子，对 免疫应答具有广泛的上调作用了本研究的目的，就是构建 双表达重组质粒pcDNA3／VPl．hIL一2，并观察IL．2基因佐 剂对CVB3 VPl所诱导的免疫应答的调节作用，为构建有 效预防柯萨奇病毒感染的DNA疫苗奠定实验基础。 f方法：利用自行设计的产物，以己成功构建的CVB3 PCR反应，扩增出具有完整真核表达构件的 CMV．VPl．BGHpA片段；将扩增产物回收纯化后，与pGEM 中文摘要 T．Easy载体连接，转化DH5。大肠杆菌，筛选重组子，提 取质粒进行酶切鉴定和测序；将扩增片段双酶切，与同样 双酶切的质粒pcDNA3／hlL一2连接，转化DH5。大肠杆菌， 提取质粒酶切鉴定，即构建成双表达重组质粒 pcDNA3／VPl一hIL．2。质粒大量扩增纯化后，肌肉注射免疫 BALB／c小鼠三次。每次免疫后第六天，断尾取血检测 CVB3中和抗体。第三次免疫后第七天用致死量CVB3感 染小鼠，观察pcDNA3／VPI-hIL．2对小鼠的免疫保护作用。 结果：(1)构建的pcDNA3／VPl一hIL．2重组质粒中的 kb的预期值， 插入片段CMV．VPl．BGHpA的长度符合1．9 经酶切鉴定和测序证实该插入片段正确无误；(2) pcDNA3／vP。一hIL-2重组质粒免疫小鼠后，能诱导机体产生 中和抗体，各次免疫后的平均抗体效价分别为1：5，l：28．28。 后的平均抗体效价分别为l：5，1：26．39，1：42．87；而 pcDNA3／VPI组只在第三次免疫后出现低水平抗体，效价 pcDNA3／hlL一2共注射组，pcDNA3／VP 1组，pcDNA3／IL．2组， pcDNA3组及生理盐水对照组生存率分别为25％，10％， 15％，5％，15％，10％；经穿检验，六组小鼠生存率无 明显差异(尸o．05)。诛 结论：(1)本研究成功的构建了双表达真核重组质粒 小鼠体内能够表达并能诱导机体产牛较单独的 pcDNA3／VPl免疫组出现更甲-、水平更高的中和抗体，且 中文摘要 抗体效价随免疫次数增加而提高。(3)在本研究所应用的 免疫程序下，pcDNA3／VPl一hIL一2双表达质粒DNA疫苗对 致死量CVB3感染无明显保护作用。 关键词：人白细胞介素2i柯萨奇病毒B组3，牲； DNA疫苗；伟j议 英文摘要 ———————————————————●-_●_-___-__●________________-_-____-______————————————_———___————————————————————一 of TheConstruction EukaryoticExpression Plasmid andtheObservation