IL-15表达质粒联合HPV基因疫苗诱导细胞免疫应答的实验研究.pdf

中文摘要 IL一1 5表达质粒联合HPV基因疫苗诱导细胞免疫 应答的实验研究 摘 要 目的：人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感 染人的皮肤和粘膜上皮细胞，与上皮细胞的良性与恶性增生 密切相关。HPV的一些亚型可以引起皮肤疣、尖锐湿疣等良 性增生性病变；而另一些亚型可以引起宫颈癌及其它生殖器 肿瘤、皮肤肿瘤、口腔肿瘤等。由于缺乏特异的有效治疗手 段，HPV感染严重影响人类的健康，因此急需研制安全有效 的疫苗。HPV目前尚不能在体外大量培养，难以研制传统疫 苗。基因疫苗具有制备简单、免疫应答持久、安全稳定、可 反复使用等优点，是一种有前途的新型疫苗。HPVl6的早期 蛋白基因E7基因是基因疫苗的理想靶抗原，研究表明 HPVl6 E7疫苗可以诱导动物产生特异性细胞免疫应答和体 液免疫应答，保护小鼠不受HPVl6阳性肿瘤细胞的攻击， 并且能抑制已经形成的肿瘤的生长甚至使肿瘤消退。但是当 该疫苗应用于灵长目动物时，其免疫原性降低；在人体中应 用该疫苗，其诱发的免疫应答更为减弱。而疫苗最终要应用 于人体，因此必须进一步提高疫苗的免疫原性。研究发现某 些细胞因子基因与基因疫苗共同注射，可以提高基因疫苗的 的受体和活性，例如：激活T细胞，特别是CD8+CTLs。除 中文摘要 了具有IL．2活性外，它还在NK细胞的活化和其功能的调控 中起关键作用。IL．15基因已经在一些实验中被用作基因疫 苗佐剂，取得了良好的促进抗原特异性免疫应答的效果。但 是还没有它对HPVl6E7基因疫苗免疫效果影响的报道，因 此本实验亚克隆了【L．15基因，构建了其真核表达质粒，与 HPVl6 E7基因疫苗共同注射于BALB／c小鼠，并观察其对 小鼠的特异性细胞免疫应答的影响。 以Sliver Beads胶回收试剂盒酶回收500bp酶切产物IL．15， 酶的作用下连接，构建真核表达质粒pcDNA3．1-IL．15。连接 产物转化感受态大肠杆菌DH．5ct,于LB培养基中过夜培养， 小量提取质粒，经EcoRI、BamHI双酶切鉴定连接产物，选 择阳性克隆进行质粒大量提取并纯化，测OD：60和OD：80进 行定量和纯度检测。pcDNA3．1．E7、pcDNA3．1同样经转化、 小量提取、双酶切鉴定、大量提取、纯化和定量。各种质粒 saline，N．S．)稀释至所需浓度，用于动物 用生理盐水(normal 免疫。雌性BALB／c小鼠，6周龄，随机分为6组，分别肌 100ug。接种前以25％高渗蔗糖溶液100ul预处理接种部位。 2周后以同样剂量加强免疫，共加强免疫3次。末次免疫1 周后取血并分离血清，双抗夹心ELISA法测定IFN．Y；无菌 取脾，制备脾淋巴细胞悬液，加入到96孔培养板中，每孔 含5X 中文摘要 灭活小牛血清，MTT法做T淋巴细胞增殖实验，以OD570 值之差代表T淋巴细胞增殖程度。组间比较采用单因素方差 分析，显著性检验水准a=0．0l。 结果：构建的pcDNA3．1．IL．15重组质粒经酶切得到 5酶切得到的基因片段 500bp的基因片段，与pGEM．T．IL．1 大小相等；pcDNA3．1．E7重组质粒经酶切得到300bp的基因 片段与目的基因片段理论值大小相等。经pcDNA3．1-E7免疫 小鼠的血清中可以检测到IFN．丫浓度为150．4p∥ml，而生理 盐水组和空质粒组均未检测到IFN．丫。pcDNA3．1．IL．15与 pcDNA3．1．E7共同注射，可以提高免疫小鼠血清中IFN．v水 平至414．1pg／ml，与E7+空质粒组、E7组比较差异有显著性 小鼠的脾淋巴细胞出现了特异性T细胞增殖反应，OD，70差 值为0．644，生理盐水组和空质粒组分别为0．228、0．322，E7 组与生理盐水组和空质粒组之问差异均有显著性(PO．01)。 性T细胞增殖反应，OD570差值为I．313，与其他各组比较差 异均有显著性(P0．01)。 结论：1本研究成功地构建了人白细胞介素15基因重组 鼠可以诱导