JNK在豚鼠丁胺卡那霉素中毒后耳蜗毛细胞的激活表达.pdf

中文摘要 前 言 JNK是丝裂原活化蛋白激酶系统的重要成员，是细胞内信号传导的重 要通路，与细胞凋亡有密切关系。氨基糖苷类药物的耳毒性已经公认，已有 研究表明氨基糖苷类药物可在耳蜗通过凋亡诱导毛细胞死亡。丁胺卡那霉 素作为一种新型的半合成广谱抗生素，疗效显著，但听觉障碍率为15．7％。 本实验结合畸变产物耳声发射，全耳蜗铺片，及免疫组化方法，研究丁胺卡 那霉索耳毒性的病变特点及活化JNK在毛细胞的表达，初步探讨耳毒性机 锚l。 材料和方法 材料：耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠12只，体重250～300克，雄 性。随机分成实验组和对照组二组，每组6只，实验组：丁胺卡那霉素 300mg·kg～·d～，肌肉注射；对照组t生理盐水等量肌肉注射，连续7天。 方法：(1)DPOAE记录方法：在隔声室内，豚鼠处于麻醉状态进行双耳 醉状态下行第二次DPOAE检测后，麻醉下开胸，4℃生理盐水经心脏灌流， 冲出全部红细胞后4％多聚甲醛灌流固定。断头，快速取出右侧听泡，分离 出耳蜗，蜗尖打孔，开放圆窗、卵圆窗，将耳蜗置于相同固定液中24小时。 甲酸一甲酸钠溶液脱钙一周，每日更换脱钙液。再移入30％蔗糖溶液4。C 下过夜。OCT包埋，沿蜗轴平行方向行10I_ma厚冰冻切片准备作免疫组化 染色(SABC法)。待切片干燥后，入3％过氧化氢溶液10分钟去除内源性 过氧化物酶，正常山羊血清室温20分钟封闭，加一抗(兔抗鼠P—JNK多克 间，蒸馏水终止显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封 片，光镜下观察。空白对照用PBS代替一抗，其余步骤不变。乳腺癌细胞 作为阳性对照。(3)耳蜗铺片标本制备：各组豚鼠麻醉状态下行第二次 DPOAE检测后，快速断头处死，取左侧昕泡，从蜗尖灌注新鲜配制的0．5％ 硝酸银溶液2～3IIll，用4％多聚甲醛溶液灌注并固定，解剖显微镜下剥离 基底膜，分回封片，自然光下曝光2—3小时，光镜下观察，摄片。实验数据 采用X±S表示，采用SPSSll．0统计软件行t检验。 结 果 1．DPOAE幅值检测 外，其余均出现下降，其2…468kHz幅值差值同对照组比较有显著性差异 (P0．01)。 2．耳蜗铺片实验组内毛细胞个别肿胀，外毛细胞纤毛部分消失，结 构不清，排列不整齐，有散在空位。外毛细胞损伤主要在底回，第二回，且多 为OHCl和OHC2。对照组内外毛细胞基本正常，排列整齐，细胞间隔均 匀，边界清楚。 粒免疫表达，信号反应呈核型，而在对照组Cord器及空白对照均呈阴性反 应，实验组中内毛细胞及支持细胞也无免疫反应。 讨 论 氨基糖苷抗生素的耳毒性已经公认。绝大多数听力损害与毛细胞损害 有关，毛细胞是一种机械一电能转换器，毛细胞通过其静纤毛感受基底膜振 动的刺激，导致静纤毛机械变行，而诱发一系列的换能过程，最后产生引起 听神经兴奋性电活动信号。丁胺卡那霉素主要损害外毛细胞，探讨其耳毒 性机制具有临床意义。 DPOAE是由两个具有一定频比关系的纯音同时刺激所诱发的声音能 量，反映了耳蜗外毛细胞的活动，常用于评估外毛细胞的功能状态，实验结 ·2· 相比有显著差异(P0．01)，频率越高，其幅度下降越大，表明丁胺卡那霉 素对豚鼠的外毛细胞损害越重，听力损害有高频损失严重的趋势。耳蜗铺 片中发现外毛细胞损害主要表现在底回和第二回，也提示高频损失严重。 Chioelo等认为：氨基糖甙类药物对末梢听器感觉毛细胞损害是主要病理变 化；首先受损的是外毛细胞(OHC)，OHC受损始于底回，渐向顶回扩展，各 (IHC)受损晚于OHC，在我们试验中发现，外毛细胞比内毛细胞损害严重， 主要表现在底回和第二回。在同一回外毛细胞中，靠近隧道的外毛细胞较 内侧毛细胞易受损害。观察结果与Chioelo等描述所相似。 研究发现，用紫外线照射细胞后，一种蛋白激酶能够使C—Jun氨基末 N—terminalkinase 末端激酶(c—Jun JNK)，是丝裂素活化蛋白激酶 增高，进而活化转录因子，影响基