翅碱蓬CMOcDNA基因克隆、测序及重组植物表达载体的构建.pdfVIP

维普资讯 中国生物工程杂志 ChinaBioteehnology，2006，26(7)：80—83 翅碱蓬 CMOcDNA基 因克隆、测序及重组 植物表达载体的构建 仲崇斌 刘长江 费 腾 袁晓东。孙丽慧 (1东北大学理学院生物技术研究所 沈阳 110004) (2沈阳农业大学食品学院 沈阳 110161 3宝生物工程有限公司 大连 116600) 摘要 从翅碱蓬叶片中提取总RNA，根据相关同源序列设计引物，使用反转录试剂盒进行 RT— PCR，扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)eDNA，进行PCR产物测序 ；然后将 CMOeDNAT—A克 隆至pMD18一T—simple载体上，经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体，进行酶切及克隆测 序鉴定。 关键词 胆碱单加氧酶 pMD18一T—simple载体 pBI121植物表达载体 大肠杆菌 JM109 中图分类号 Q785 高盐环境严重影响植物的生长和发育，是造成作 口g)种子采 自辽宁盘锦地区盐碱地，种植于温室内， 物减产的主要原因之一。某些高等植物在盐、干旱等 盐水梯度浓度诱导；质粒 pMD18-T—simple、大肠杆菌 渗透胁迫下，可以大量合成并积累甜菜碱作为无毒的 JM109购 自TaKaRa公司；植物表达载体 pBI121为 渗透调节剂。它可增加细胞的渗透压，保护酶和膜免 TaKaRa公司友情赠送 。 受损伤，减轻胁迫效应。在高等植物中，甜菜碱经两步 1．1．2 主要试剂 限制性内切酶 BamHI、ScaI、 I， 酶催氧化得到，即胆碱一甜菜碱醛一甜菜碱，催化第一 PyrobestDNA聚合酶，LATaqDNA聚合酶，标准 DNA， 步反应的酶是胆碱单加氧酶 (cholinemonooxygenase， X—gal，IPTG，14DNA连接酶，PCR产物 回收试剂盒， CMO)。，催化第二步反应的酶是甜菜碱醛脱氢酶 DNA连接试剂盒和质粒提取试剂盒均购 自Takara公 (betainealdehydedehydrogenase，BADH) 。到 目前 司；其余试剂为国产分析纯。 为止，CMO基因已从菠菜 、甜菜 等植物中得到克隆 1．1．3 培养基和培养条件 大肠杆菌培养基为LB培 和鉴定，不同生物的CMO基因有较高的同源性。本文 养基，培养温度 37~C，摇床转速200r／min，氨苄青霉素 利用RT—PCR技术从耐盐植物翅碱蓬(Suaedahetroptera 浓度为0．01％，卡那霉素浓度为0．01％。 kitag)中分离克隆CMO基因，然后将 CMOeDNA基因 1．2 方 法 克隆至pMD18-T-simple载体上，经测序正确后亚克隆 1．2．1 PCR引物设计 引物由TaKaRa公司合成。根 至pBI121植物表达载体，进行酶切及 DNA测序鉴定。 据已报道物种CMOeDNA的同源序列和表达载体克隆 从而为进一步研究 CMO基因在甜菜碱合成及提高植 位点内切酶图谱分析结果，设计 1对 (29—30bp)含合 物耐盐性中的作用和找到更有效的耐盐基因，培育耐 适内切酶位点的引物序列，其中在上游引物CTA068F末 盐植物新品种打下了基础。 端引入BamHI酶切位点，在下游引物CTA069R末端引 入SacI酶切位点，待亚克隆之用。上游引物 CTA068F： 1 材料与方法 5一GGATCC姗 GATGGCTGCATCAGC从 GT-3，下游 1．1 材 料 引物 CI悯 R：5一GAGCTCTCAC1-I℃AAAATFIC~TGCA 1．1．1 植