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【资源】PCR引物设计的黄金法则 - 医博园
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【资源】PCR引物设计的黄金法则
jack99 2008-01-22 19:27
1.引物最好在模板cDNA 的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上有哪些信誉好的足球投注网站不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment ),各基因
医博园版主 相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
发贴: 239 引物长度(primer length)常用的是18-27 bp ,但不应大于38 ,因为过长会导致其延伸温度大于74 ℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
积分: 231 3. 引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72 ℃。
得票 : 21 GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的
状态: 离线 解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5~10 ℃。若按公式Tm= 4 (G+C)+2 (A+T )估计引物的
Tm值,则有效引物的Tm为55~80 ℃,其Tm值最好接近72 ℃以使复性条件最佳。
4. 引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A ,最好选择T 。
引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A 时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T 时,错配的引发效
率大大降低,G、C错配的引发效率介于A 、T之间,所以3′端最好选择T 。
6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(False priming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引
物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C ,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自
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